ICS 65.020.40 B 61 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 1907—2014 板栗疫病菌分子检测技术规范 2014 - 11 - 11 发布 四川省质量技术监督局 2014 - 12 - 01 实施 发 布 DB51/T 1907—2014 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 2 5 试剂和设备 ........................................................................ 2 6 结果判定 .......................................................................... 5 7 结果表述 .......................................................................... 5 8 检测过程防止污染措施 .............................................................. 5 9 废弃物处理 ........................................................................ 5 附录 A（资料性附录） 板栗疫病基因组 DNA PCR 扩增结果 ................................. 6 附录 B（资料性附录） PCR 产物序列 .................................................... 7 I DB51/T 1907—2014 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则》的规定编写. 本标准由四川省林业厅提出并归口 本标准由四川省林业厅负责解释 本标准由四川省质量技术监督局批准 本标准起草单位：四川农业大学 本标准主要起草人：朱天辉、麻文建、李姝江、韩珊、谯天敏、张丽娜。 II DB51/T 1907—2014 板栗疫病菌分子检测技术规范 1 范围 本标准规定了板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）的 PCR 检测技术的一般原则和技术要求。 本标准适用于四川省境板栗及山毛榉科植物枝干组织中板栗疫病菌的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6682-2008 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 SN/T 1193 基因检测实验室技术要求 SN/T 2080-2008 栎树猝死病菌检疫鉴定方法 SN/T 2965-2011 植物病原真菌分子生物学检测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 板栗疫病 Chestnut blight 板栗疫病又名板栗胴枯病、腐烂病、干枯病等，是板栗栽培区的主要病害，主要危害主、侧枝及主 干的树皮，严重时造成整个枝条或全株死亡。 3.2 板栗疫病菌 Cyphonectria parasitic 板栗疫病菌学名为[Cyphonectria parasitic (Murr.) Barr]。隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)，核菌纲 (Pyrenomycetes)，球壳菌目（Sphaeriales），间座壳科（Diaporthaceae）真菌。主要寄生于中国板栗、欧 洲板栗、锥栗、美洲板栗等山毛榉科植物。 3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR 用于放大扩增特定的 DNA 片段的反应。在一定的温度条件下，将模板 DNA 的双链解开成单链， 在 DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，以 4 种 dNTP（deoxyribonucleoside triphosphate, 脱 氧核苷酸三磷酸）为底物，利用退火使引物得以延伸，一般经过 30 个左右的循环，DNA 片段扩增倍数 就可达到 106 以上。 3.4 1 DB51/T 1907—2014 双重 PCR Duplex PCR 双重 PCR 是多重 PCR 的一种，指同一反应体系里加上两对引物，同时扩增两个核酸片段的反应。 3.5 扩增引物 primer 人工合成的寡核苷酸，与模板 DNA 的一段序列上碱基互补配对，在 PCR 扩增中起到引导 DNA 扩 增的作用。 3.6 扩增模板 template 用于 DNA 体外扩增的目标序列。 3.7 阳性对照 positive control 含有目的核酸序列的 DNA 片段，包括从已知含有目标序列的样品或含有目标序列的标准样品中所 提取的 DNA 序列。证明检测样品中含有目标序列。 3.8 阴性对照 negative control 不含有目标核酸序列的 DNA 片段，证明检测样品中不含有目标序列。 4 原理 提取板栗枝干组织样品或菌丝基因组 DNA 样品；以基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增；经过琼脂 糖凝胶电泳，检测 PCR 扩增产物；对 PCR 扩增产物进行测序，将测序结果与参考序列比对，判断检测 样品中是否含有板栗疫病菌。 5 试剂和设备 除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB 6682-2008 的要求。 5.1 试剂 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.1.7 5.1.8 5.1.9 5.1.10 5.1.11 2 75 %酒精。 液氮。 三（羟甲基）氨基甲烷(Tris-HCl)。 氯化镁（MgCl2）。 盐酸 HCl。 乙二胺四乙酸(EDTA)。 氢氧化钠（NaOH）。 氯化钾( KCl)。 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。 无水乙醇。 DB51/T 1907—2014 5.1.12 5.1.13 5.1.14 5.1.15 5.1.16 5.1.17 5.1.18 5.1.19 5.1.20 5.1.21 苯酚。 三氯甲烷。 异丙醇。 异戊醇。 蛋白酶 K。 TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0。 10×PCR Buffer: 100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol/L KCl。 Taq DNA 聚合酶。 dNTP (三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 dGTP、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧 核苷酸 dTTP、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 dCTP)。 5.1.21 PCR 引物：PCR 引物信息见表 1。 表1 引物名称 PCR 引物长度及扩增片段信息 引物序列 碱基数（bp） CP1 上游：5＇－CGGCCCACTAAACTCTTTGT－3＇ 20 CP2 下游：5＇－ATTTCAGGGCCTACCGTTTT－3＇ 20 SC1 上游：5＇－AACGGTGACCCTTCTGGGGC－3＇ 20 SC2 下游：5＇－AACGGTGACCGCAAAGGACTC－3＇ 21 扩增片段大小（bp） 285 389 5.1.22 DNA Marker：分子量标准品 DL 1000 或 DL 2000 bp（bp：base pair，碱基对）。 5.1.23 琼脂糖。 5.1.24 核酸染料（Golden View 或类似产品）。 5.1.25 溴酚蓝 5.1.26 1×TAE 电泳缓冲液：量取 50×TAE (242 g Tris，57.1 mL 冰乙酸，100 mL 0.5 mol/L Na2EDTA， 用盐酸或氢氧化钠调节 pH 至 8.0，定容 1 L), 用蒸馏水稀释 50 倍。 5.2 仪器设备 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 5.2.9 5.2.10 5.2.11 5.2.12 5.2.13 5.3 5.3.1 PCR 仪。 高速离心机：最高转速不小于 12 000rpm。 微量移液器（0.5 μL～10 μL，10 μL～100 μL，100 μL～1000 μL）。 冰箱(冷藏室 4℃和冷冻室-20℃)。 超净工作台。 恒温水浴锅。 天平（感量 0.001 g）。 DNA 水平电泳仪。 凝胶成像分析系统。 灭菌枪头（2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL）。 灭菌 PCR 反应管 0.2 mL。 离心管 2 mL。 超低温冰箱(-70℃)。 检测步骤 基因组 DNA 提取 3 DB51/T 1907—2014 将疑似板栗疫病症状的主干、枝条或分离出来的菌丝，按 CTAB 法提取 DNA。其中，样本为植物组 织时，DNA 提取的一般步骤如下： （1）取 100 mg 左右样本，将表面用用 75 %酒精表面消毒后切成小块。 （2）用液氮研磨成粉末装入 2 mL 离心管中。 （2）加入 500 μL 经过 60℃预热的 CTAB 缓冲液和 0.1 g 蛋白酶 K，充分混匀，65℃水浴 60 min； 12 000rpm 离心 10 min，取上清。 （3）加入 700 μL 体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，静置 10 min 后，12 000 rpm 离心 10 min，取上清。 （3）加入 500 μL 三氯甲烷：异戊醇（24：