ICS 65.020.40 B 61 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2410—2017 应用微卫星 DNA 标记亚洲黑熊个体司法鉴 定技术规范 2017 - 09 - 19 发布 四川省质量技术监督局 2017 - 10 - 01 实施 发 布 DB51/T 2410—2017 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语、定义和缩略语 ................................................................ 1 4 PCR 引物的设计、合成与荧光标记 ..................................................... 2 5 DNA 的提取与检测................................................................... 2 6 PCR 反应与 PCR 产物测序 ............................................................. 2 7 基因分型 .......................................................................... 3 8 个体识别 .......................................................................... 3 附录 A（规范性附录） 亚洲黑熊微卫星标记信息 .......................................... 5 I DB51/T 2410—2017 前 言 本标准按 GB/T 1.1－2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》的规定编写。 本标准由四川省林业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准主要起草单位：四川省林业科学研究院。 本标准主要起草人：靳伟 毛毳 费然 夏云 刘雯昊。 II DB51/T 2410—2017 应用微卫星 DNA 标记亚洲黑熊个体司法鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了利用DNA 简单重复序列微卫星分子标记对亚洲黑熊进行司法鉴定的原理、试剂、仪器、 分析步骤和结果判定标准。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GA/T 383-2002 法庭科学DNA实验室检验规范 SN/T 1193-2003 基因检验实验室技术要求 NY/T 1673-2008 畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程 3 术语、定义和缩略语 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微卫星分子标记 Microsatellite marker 微卫星（microsatellite）是指基因组中由1-6个核苷酸为基本重复单元组成的DNA串联重复序列， 例如（AC）n、（ACG）n、（ATTT ）n等，也称为短串联重复序列（Short tandem repeats，STR）或简 单重复序列（Simple sequences repeats，SSR）。在个体间重复次数发生变化的多态性微卫星位点， 可以作为微卫星标记使用。 3.2 DNA 样品 DNA sample 是指利用亚洲黑熊组织（如毛发、血液、精液、肌肉组织等）或新鲜粪便提取的亚洲黑熊基因组DNA。 3.3 聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction,PCR 用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热 DNA 聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。 3.4 微卫星特异性引物 Microsatellite specific primers 1 DB51/T 2410—2017 用于亚洲黑熊微卫星DNA分子鉴定选用的一套微卫星引物。具有多态性、稳定性、重复性等综合特 点。统一推荐使用16个微卫星标记（附录A），其中1-11号为基本标记，12-16号为备选标记，可根据工 作目标选用合适数量的微卫星标记。只有当基本标记不够用时，才使用备选标记。 4 PCR 引物的设计、合成与荧光标记 推荐使用的16个微卫星标记的PCR引物序列设计参见附录A，将序列送有关公司合成，详细记录引物 合成的生物公司名称，合成的批次及每个引物标记的颜色，方便后续做系统误差校正。 5 DNA 的提取与检测 5.1 鉴定样品 待鉴定样品可以是皮毛、肌肉、骨骼、各种器官、组织、血液等。 通过现场或实验室取样，将采集到的样品（如：肌肉、肝脏、皮毛等）用蒸馏水洗净后放入盛有95 ％酒精的离心管中，4℃保存待用。 5.2 基因组 DNA 的提取 把取回样品用蒸馏水洗净后，用标准的SDS变性、蛋白酶K消化和酚／氯仿抽提方法提取总DNA，具 体操作参照《分子克隆实验指南 （第3版）》等的方法沉淀DNA，收集絮状沉淀，用70%乙醇洗涤两次， 室温干燥后加入适量 TE溶解DNA。 注：以上为推荐的一种DNA提取方法。其他DNA提取方法若DNA质量能够符合PCR扩增需要的都可用于本标准。 5.3 DNA 浓度检测 5.3.1 紫外吸收定性测试 应保证A260／A280比值在1.8–2.0范围内，方可正常进行后续实验。 5.3.2 紫外吸收定量测试 应保证DNA浓度在10 μg/mL以上，方可正常进行后续实验。 6 PCR 反应与 PCR 产物测序 6.1 2 PCR 扩增的反应体系和扩增程序 DB51/T 2410—2017 10×PCR buffer 2.0 μL MgCl2 (25mmol/L) 2.0 μL dNTP (2.5mM) 1.0 μL Taq polymerase (2.5U/μL) 0.2μL 引物-F（15 pmol/μL） 0.5μL 引物-R（15pmol/μL） 0.5μL 模板DNA 2.0μL ddH2O 11.0 μL BSA (1mg/mL) 0.8 μL 合计 20 μL PCR扩增程序：95℃预变性5分钟，然后35个循环包括94℃变性 50 s, 55℃-65℃（根据不同的引物 确定）退火45s, 72 ℃延伸30s，最后72 ℃延伸10分钟，4℃保存。 6.2 PCR 产物的质量检测 当PCR扩增完成后，取PCR产物5μL，经1.5%-2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小 正确，表明PCR扩增成功； 将符合质量要求的PCR产物避光（使用锡箔纸盒）存放于4℃冰箱，用于基因分型； 对于不符合质量要求的样品，要进行PCR条件优化，重新进行PCR扩增和质量检测； PCR条件的优化主要是通过改变Mg2+的浓度、退火温度以及增加DNA的用量等进行。 7 基因分型 将符合质量要求的PCR产物送有关公司进行基因扫描分型。 为了消除系统误差，所有样品均送同一家公司、使用同一型号分型设备进行基因分型，所有批次都 选用相同分子内标，并且使用同一数据判读软件进行数据判读，避免产生系统误差；也请详细记录上述 信息，方便后续做系统误差校正。根据该样品在不同批次的分型值来消除系统误差，校正数值。研究中， 如果基因分型的结果与该批次样品的基因分型值范围偏差较大，或者基因分型的结果峰图影响数值的读 取（有干扰峰或者峰值较低等），则重新进行PCR扩增和基因分型，直至获得高可信度的基因分型结果。 为了获得更加可信的基因型，最好采用多管PCR（multi-tube approach）扩增方案。 8 个体识别 个体鉴定包括对2个或2个以上的个体进行检测（“直接比较”）和对待测样品进行检测后利用其检 测数据和数据库中个体的数据进行比对（“数据库比较”）。 8.1 结果判定 用附录A中16个微卫星标记检测，获得待测个体在这些位点的等位变异数据，利用这些数据进行个 体比较： 用Microsatellite tools软件根据微卫星位点的分型数据进行个体识别； 当两个或两个以上的样品微卫星标记分型结果完全一致时，判定样品来自同一个体； 当两个样品的微卫星标记分型结果中有两个及以上标记分型结果不同时，判定样品来自不同个体； 3 DB51/T 2410—2017 当两个样品的微卫星标记分型结果中只有一个标记差异时，对出现差异的位点重复PCR扩增和基因 分型，以进一步确认； 8.2 结果表述 比较位点数：_______，差异位点数: _______，差异位点为: _______，判定为_______。 4 DB51/T 2410—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 亚洲黑熊微卫星标记信息 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 标记名称 UamA107 UamB1 UamB5 UamB8 UamC8 UamC11 UamD3 UamD2 UamD11 UamD103 UamD113 UamD118 UT1 UT4 UT29 UT35 引物序列（5’—3’） F: ATTCCCATTGGTGCCTCT R: CCCCCATCAAAAATCCAT F: GGCACCAATGTTACTTTCCTAC R: GTGGGTGGAGAGAAGTTTAGAA F: CCGGTGGATCTATCTCAGAGT R: GGGATCTTGTCTATCCTGCTC F: CATACCTGTGGCTGAATCTAG R: AGCACTCAGGATAGTTTCACTC F: TTAAGGACACGTTTCAAACCTA R: CCAATTAGATCCGAATTTCTG F: TCTGAATGCCCTCTTTAGTGAG R: GCAAAACCCTTAAAACTCAACA F: TGGG