ICS 65.020.40 B 61 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2406—2017 重点保护野生动物（偶蹄目、奇蹄目）DNA 条形码司法鉴定技术规范 2017 - 09 - 19 发布 四川省质量技术监督局 2017 - 10 - 01 实施 发 布 DB51/T 2406—2017 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语、定义和缩略语 ................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 2 5 扩增引物 .......................................................................... 2 6 DNA 的提取与检测................................................................... 2 7 PCR 反应与 PCR 产物测序 ............................................................. 3 8 数据分析和种类鉴定 ................................................................ 3 I DB51/T 2406—2017 前 言 本标准按 GB/T 1.1－2009 《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》的规定编写。 本标准由四川省林业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准主要起草单位：四川省林业科学研究院。 本标准主要起草人：靳伟 毛毳 费然 夏云 刘雯昊。 II DB51/T 2406—2017 重点保护野生动物（偶蹄目、奇蹄目）DNA 条形码司法鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了利用DNA 条形码对重点保护野生动物（偶蹄目、奇蹄目）进行司法鉴定的原理、试剂、 仪器、分析步骤和结果判定标准。本标准适用于重点保护野生动物（偶蹄目、奇蹄目）DNA鉴定等方面 的物种鉴定工作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GA/T 383-2002 法庭科学DNA实验室检验规范 SN/T 1193-2003 基因检验实验室技术要求 SN/T 4625-2016 DNA条形码筛选与质量要求 SN/T 4626-2016 DNA条形码物种鉴定操作规程 3 术语、定义和缩略语 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA 条形码 DNA Barcoding DNA条形码是利用生物体内一段标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的 DNA 片段对物种进行 快速准确鉴定的技术。在动物中，通常选择细胞色素c氧化酶亚基I （COI）作为标准的 DNA片段。 3.2 细胞色素 c 氧化酶亚基 I Cytochrome Coxidase I, COI 一段位于线粒体基因组上的蛋白编码基因，其基因的一部分通常选作动物DNA条形码鉴定的标准片 段。 3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction,PCR 用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热 DNA 聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。 3.4 DNA 序列测定 DNA sequencing 测定DNA分子的核苷酸排列顺序。 1 DB51/T 2406—2017 3.5 序列比对 alignment 为确定两个或多个序列之间的相似性以至于同源性，而将他们按照一定的规律排列。 4 原理 DNA 条形码的理念来源于现代商品零售业条形编码系统。它利用 DNA 序列信息量大的优势，即每 个碱基位点有A、T、G、C 四种可能的情况，以一种四进制的方式进行排列组合。利用这种DNA序列排列 组合方式在物种间的差异，可以有效的将物种区分开。线粒体COI基因是位于线粒体DNA的蛋白质编码基 因。经大量的统计分析后，COI 序列 5’端的 658 bp 的碱基序列能有效反应物种间差异，并且该段基 因易于扩增，进化速度较快同时又相对保守，既有足够的变异又便于通用引物扩增，DNA序列很少有插 入与缺失现象，便于序列比对分析。 利用通用引物结合特异引物对重点保护野生动物（偶蹄目、奇蹄目）线粒体COI进行PCR扩增，得到 目的片段进行纯化、测序，只要将所有序列进行两两比较并计算其差异值，然后根据差异值来确定物种 之间的关系。 5 扩增引物 优先使用哺乳动物通用引物（Ivanova et al.,2012）： LepF1-t1：TgT AAA ACg ACg gCC AgT ATT CAA CCA ATC ATA AAg ATA TTg g LepR1-t1：CAg gAA ACA gCT ATg ACT AAA CTT CTg gAT gTC CAA AAA ATC A 如果上述引物对样品扩增困难，可采用以下特异引物进行扩增，或者与上述引物进行混合使用。 AP-F: TAC TGG AGT AAA AGT CTT TAG CTG ACT AGC AA AP-W: ACg ACg gCC AgT TCT CAA CCA ACC ACA ARg AYA TYg g 注：Ivanova, N. V., Clare, E. L., & Borisenko, A. V. (2012). DNA barcoding in mammals. In J. W. Kress & D. Erickson (Eds.), DNA Barcodes: Methods and Protocols (Vol. 858, pp. 153-182). New York City, NY: Humana Press. 6 DNA 的提取与检测 6.1 鉴定样品 待鉴定样品可以是皮毛、肌肉、骨骼、各种器官、组织、血液等。 通过现场或实验室取样，将采集到的样品（如：肌肉、肝脏、皮毛等）用蒸馏水洗净后放入盛有95 ％酒精的离心管中，4℃保存待用。 6.2 引物合成 将上述扩增引物序列送有关公司合成。 6.3 2 基因组 DNA 的提取 DB51/T 2406—2017 把取回样品用蒸馏水洗净后，用标准的SDS变性、蛋白酶K消化和酚／氯仿抽提方法提取总DNA，具 体操作参照《分子克隆实验指南 （第3版）》等的方法沉淀DNA，收集絮状沉淀，用70%乙醇洗涤两次， 室温干燥后加入适量 TE溶解DNA。 注：以上为推荐的一种DNA提取方法。其他DNA提取方法若DNA质量能够符合PCR扩增需要的都可用于 本标准。 6.4 DNA 浓度检测 6.4.1 紫外吸收定性测试 应保证A260／A280比值在1.8–2.0范围内，方可正常进行后续实验。 6.4.2 紫外吸收定量测试 应保证DNA浓度在10 μg/mL以上，方可正常进行后续实验。 7 7.1 PCR 反应与 PCR 产物测序 PCR 扩增的反应体系和扩增程序 10×PCR buffer 2.0 μL MgCl2 (25mmol/L) 2.0 μL dNTP (2.5mM) 1.0 μL Taq polymerase (2.5U/μL) 0.2μL 引物-F（15 pmol/μL） 0.5μL 引物-R（15pmol/μL） 0.5μL 模板DNA 2.0μL ddH2O 11.0 μL BSA (1mg/mL) 0.8 μL 合计 20 μL PCR扩增程序：95℃预变性5分钟，然后35个循环包括94℃变性 50 s, 55℃-65℃（根据不同的引物 确定）退火45s, 72 ℃延伸30s，最后72 ℃延伸10分钟，4℃保存。 7.2 PCR 产物的质量检测 当PCR扩增完成后，取PCR产物5μL，经1.5%-2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小 正确，表明PCR扩增成功。 7.3 PCR 产物的回收 用小量胶回收纯化试剂盒并按照使用说明进行回收纯化。 7.4 PCR 回收产物的测序 送专业测序公司进行测序，保证每条序列均经过双向测定，以确保序列的准确性。 8 数据分析和种类鉴定 3 DB51/T 2406—2017 利用NCBI(美国国立生物技术信息中心)的GenBank数据库的Blastn基因搜索程序，和生命条形码数 据库(BOLD)对待鉴定个体的DNA序列进行比对分析。根据差异值来确定物种之间的关系。 一般情况下，序列相似度≥98 % 确定为同一物种。 同一种待检动物由于不同的地理种群的遗传分化，可能导致序列相似度＜98% 时，结合其它物种鉴 定方法分析。 GenBank数据库中收录了绝大多数物种的COI基因序列，对于未知物种的序列我们将其提交到 GenBank数据库中，并参考其它物种鉴定方法鉴定其种类。 _________________________________ 4 DB51/T 2406—2017