ICS 65.020.40 B 61 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2403—2017 野生大熊猫粪便样品采集及 DNA 提取技术规程 2017 - 09 - 19 发布 四川省质量技术监督局 2017 - 10 - 01 实施 发 布 DB51/T 2403—2017 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 采样频次、时间和样线设计 .......................................................... 1 5 粪便样品的采集和保存方法 .......................................................... 2 附录 A（规范性附录） 大熊猫粪便样品采集记录表 ........................................ 4 附录 B（规范性附录） 四川各保护区大熊猫粪便样品编号 .................................. 5 I DB51/T 2403—2017 前 言 本标准根据 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。 本标准由四川省林业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川省野生动植物资源保护管理站 本标准主要起草人：岳碧松 魏辅文 张和民 沈富军 杨旭煜 古晓东 II DB51/T 2403—2017 野生大熊猫粪便样品采集及 DNA 提取技术规程 1 范围 本标准规定了野生大熊猫新鲜粪便采集和 DNA 提取技术规程。 本标准适用于四川省野生大熊猫新鲜粪便样品采集和DNA提取。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB51/T 2288-2016 野生大熊猫种群动态监测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 大熊猫栖息地 habitats of giant panda 是指适合于大熊猫生活的环境范围。 3.2 GIS Geographic Information System 地理信息系统 4 4.1 采样频次、时间和样线设计 采样频次与时间 野生大熊猫新鲜粪便样品采集可在春季化雪后（繁殖季节）和冬季积雪前（非繁殖季节）开展；对 于交通比较方便的大熊猫分布密集区，可以根据具体情况和研究目标增加采样次数。 各地可根据当地大熊猫的习性以及当地的物候、气候、大熊猫主食竹发笋规律、野外工作条件和后 勤保障等因素，确定具体采样时间。 野外采样工作应尽量在最短时间内完成，一般为10-15天。 4.2 采样路线 以1:5万电子地图或遥感卫星图片为基本工作图，以全国第四次大熊猫调查结果为依据，采用GIS 2 方法将保护区大熊猫栖息地划分为若干个面积为2 km 的网格，每个网格作为1个采样小区，并编号。 取样小区的划分尽量与全国第四次大熊猫调查保持一致。 1 DB51/T 2403—2017 在单个小区内，根据地形、地貌、道路、河流、植被、大熊猫主食竹等因素，以最短的距离覆盖最 多的生境类型为原则，布设实际采样路线，样线长度不得少于1.5 km，尽量形成“S”形或“Z”形路线。 5 粪便样品的采集和保存方法 5.1 采样工具 手持终端设备、GPS定位仪、罗盘、地形图、记录表格、一次性PE手套、封口袋、500ml塑料样品瓶、 无水乙醇、标记笔、铅笔、标签纸、标记胶带、GPS数码照相机等。 5.2 粪便新鲜程度判定 以大熊猫粪便表面是否有粘液和粘液的光泽、粪便完整程度、颜色以及气味等判断大熊猫粪便的新 鲜程度，其中以大熊猫粪便表面附有粘液为主要标准。 1天以内：粪便颜色保持绿色或与调查季节竹子颜色相近、表面有明显粘液、且向光和贴近地面一 侧的粘液光泽基本无差异。 2-5天：粪便颜色与调查季节竹子颜色相近，表面有较多粘液，向光一面的光泽消失或不明显、贴 近地面一侧的表面有光泽。 6-10天：粪便颜色接近深绿色，表面有少量粘液，向光一面的表面无光泽。 5.3 粪便样品的选取原则 应尽量采集5天以内的大熊猫新鲜粪便，在寒冷干燥季节，可采集6-10天的粪便样品。10天以上的 粪便不采集。 同一堆粪便只采集一份样品； 当多堆新鲜粪便距离较近时，即使判定为同一只熊猫，也可采集多份样品，以增加DNA量，但需 在记录表中加以注明。 直线距离100 m以上的新鲜粪便都要进行采样，以确保DNA提取成功和充足的DNA量； 若遇到大熊猫求偶交配场地（通常出现在3-5月），采集原则为近距离、高强度采样，即使粪堆较 近，也应分别采集； 若遇到疑似大熊猫母幼粪便样品，应分开采集粪便；依据母幼大熊猫粪便大小有明显差异作出判断。 5.4 样品采集方法 采集大熊猫新鲜粪便样品时，应佩戴一次性PE手套。禁止直接用手拾取大熊猫粪便，以避免人为因 素导致的样品污染；每次采样时必须更换新的PE手套，以避免样品间的交叉污染。 直接剥取新鲜粪便的粘液表层放入盛有无水酒精的样品瓶中，拧紧瓶盖后上下用力摆动数次，使样 品得到充分湿润，并检查是否有液体渗漏。贴上样品标签纸，写上样品编号和坐标，最后在样品瓶外套 一层封口袋，并再次写上样品编号，以避免酒精漏出导致编号丢失。 如果符合采样条件的粪便仅有少数几团时，应尽量多取一些粘液表层及浅层样品，确保能够获得充 足的DNA量。 如果符合采样条件的粪便是一堆或多堆时，应采集最新鲜和靠近中间的粪团样品，以避免边缘污染。 同一堆粪便要尽量多取样品，如果样品瓶容量有限，可以在用力摆动洗脱后，用镊子取出大的粪便 残渣，然后继续取样。 5.5 2 样品记录与编号 DB51/T 2403—2017 在采集粪便样品的同时，应填写《大熊猫粪便样品采集记录表》（附录A）。记录采样坐标（采用 十进制）、海拔、新鲜程度及生境状况。 有条件的保护区可用手持移动终端录入电子信息表，自动记录坐标和海拔，并拍摄粪便照片和生境 照片；用带有GPS的数码照相机拍摄清晰的带坐标的照片。 粪便样品采集编号规则为：县名首写字母（三位）+ 保护区名首写字母（两位）+采样小区编号+ 样品号，如“PWX-WL-1-F1”表示平武县王朗第1号小区内采集的第1处粪便样品（附录B）。小区内采集 的多个样品依次按照F1、F2、F3…的顺序编号。 晚上回到宿营地后，必须对当日采样记录进行整理，核对样品编号与记录表编号是否一致，检查记 录内容是否完整无误，并及时纠正补充。 5.6 样品的临时保存 野外样品采回后，应仔细检查核对标签和记录，并补充酒精量至样品完全浸没为宜。 酒精中的样品可以室内常温保存；有条件时可进行冷藏或冷冻保存，直到样品送到相关实验室。 5.7 样品的运输和实验室保存 野外样品采集完成后应于10日内送到相关分子生物学实验室进行保存，并尽快进行DNA提取工作； 由于无水乙醇是易燃易爆的化学品，样品应通过专用汽车运送，并注意车内通风，禁止车内吸烟。 运输过程中样品应远离火源，避免挤压。 样品DNA提取和保存方法 5.8 粪便样品的 DNA 提取 从大熊猫粪便中提取DNA，推荐使用粪便DNA提取专用商品试剂盒，具体方法参考试剂盒使用说明。 5.9 DNA 的保存 将装有总DNA的离心管保存在-20 ℃冰箱备用；或在-80 ℃超低温冰箱中长期保存。 3 DB51/T 2403—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 大熊猫粪便样品采集记录表 保护区大熊猫粪便样品采集记录表 采样人： 1 采样日期： 小区 样品 新鲜度 北纬 东经 海拔 取样 编号 编号 （天） （十进制） （十进制） (m) 团数 F01 F02 2 F01 F02 4 天气： 生境简述 DB51/T 2403—2017 BB 附 录 B （规范性附录） 四川各保护区大熊猫粪便样品编号 保护区名称 市县名 编号 四川千佛山国家级自然保护区 安县 AX-QFS- 四川蜂桶寨国家级自然保护区 宝兴县 BXX-FTZ- 四川小寨子沟国家级自然保护区 北川县 BCX-XZZ- 四川片口自然保护区 北川县 BCX-PK- 四川鞍子河自然保护区 崇州市 CZS-AZH- 四川黑水河自然保护区 大邑县 DYX-HSH- 四川龙溪-虹口国家级自然保护区 都江堰市 DJY-LXHK- 四川黑竹沟国家级自然保护区 峨边县 EBX-HZG- 四川马鞍山大熊猫自然保护区 甘洛县 GLX-MAS- 四川贡嘎山国家级自然保护区 甘孜州 GZZ-GGS 四川瓦屋山自然保护区 洪雅县 HYX-WWS- 四川金口河八月林大熊猫保护区 金口河区 JKH-BYL- 四川湾坝自然保护区 九龙县 JLX-WB- 四川九寨沟国家级自然保护区 九寨沟县 JZX-JZG- 四川白河自然保护区 九寨沟县 JZG-BH- 四川勿角自然保护区 九寨沟县 JZG-WJ- 四川贡杠岭自然保护区 九寨沟县 JZG-GGL- 四川麻咪泽自然保护区 雷波县 LBX-MMZ- 四川米亚罗自然保护区 理县 LX-MYL- 四川马边大风顶国家级自然保护区 马边县 MBX-DFD- 四川宝顶沟自然保护区 茂县 MX-BDG- 四川九顶山自然保护区 茂县 MX-JDS- 四川美姑大风顶国家级自然保护区 美姑县 MGX-DFD- 四川冶勒自然保护区 冕宁县 MNX-YL- 四川芹菜坪自然保护区 沐川县 MCX-QCP- 四川白水河国家级自然保护区 彭州市 PZS-BSH- 四川王朗国家级自然保护区