ICS11.020 C 05 S 中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 5942018 蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱 酯酶等位基因检测法 Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele intheMuscadomestica 行业标准信息服务平台 2018-03-01发布 2018-08-01实施 中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布 WS/T5942018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准主要起草单位：中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预 防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行 病研究所、上海市疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷 培恩。 行业标准信息服务平台 I WS/T5942018 蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法 1范围 本标准规定了家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测方法。 本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸位点基因型的检测。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 乙酰胆碱酯酶 每acetyl cholinesterase 存在于生物体的一种水解酶，由乙酰胆碱酯酶基因ace编码。 2. 2 等位基因allele 存在于同一物种的相同基因的不同形式互称为等位基因。 2. 3 342G、342V和342A 342G、342V和342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸残基位点上的氨基酸为甘氨酸（G1y）、 缬氨酸（Val）和丙氨酸（Ala） 3 3样本采集 采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内，浸泡在100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在 4℃条件下短期（6个月内）保存，可在-20℃以下长期保存。 4引物 引物F的序列为CGGTGCATTTGGGTTTCTAC，引物R的序列为CGTAACCGCTAAGATCTGCTG。引物设计参照附 录A。配制为10umo1/L浓度，保存于-20℃冰柜。 5仪器设备 5.1PCR（聚合酶链式反应）仪。 5.2琼脂糖凝胶电泳仪。 1 WS/T5942018 5.3凝胶成像仪。 5.4恒温水浴锅。 6主要试剂 6.1DNA聚合酶（Taq酶）。 6.2限制性内切酶Bsp1286l。 6.3限制性内切酶Eael。 7操作步骤 7.1在PCR管中加入10×PCR缓冲液（含100mmo1/LTris-HC1，500mmol/LKC1，15mmo1/LMgC12) 2.5μL，dNTP（2.5mmo1/L）2.0μL，引物F0.5μL，引物R0.5μL，单头家蝇的基因组DNA1μL （100ng～300ng，提取方法可参见附录B，也可用商售的DNA提取试剂盒或其他类似方法提取）和Taq 酶（2～5个单位），用灭菌水补齐至25μL，混匀。 7.2将PCR管放入PCR仪中，设置PCR反应程序为：94℃3min；94℃30S，50℃30S，72℃ 30s，35个循环；72℃10min。运行程序。 7.3PCR运行结束后，取5μLPCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在160V，电泳 20min后在紫外光下检测，有清楚单一的609bp的条带的PCR产物用于进行以下酶切反应。 7.4取合格样品（即电泳检测产物为609bp）的PCR产物设置两个酶切反应，反应A用Bsp1286I酶、 反应B用EaeI酶进行酶切，酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行（参见附录C）。 7.5将酶切后的产物上样在1.5%的琼脂糖凝胶上，电压设定在160V，电泳20min后在紫外光下检 测。 8基因型确定 根据酶切产物的电泳结果（参见附录D），确定家蝇个体的乙酰胆碱酯酶的基因型，见表1。 表1家蝇个体乙酰胆碱酯酶的基因型确定 反应I（加Bsp1286I酶切） 反应II (加EaeI酶切) 乙酰胆碱酯酶342氨基酸位点基因型 361bp、248bp 609bp 敏感型纯合子（G/G） 609bp 609bp 不敏感I型纯合子（V/V） 609bp 361bp、248bp 不敏感II型纯合子（A/A） 609bp 609bp、361bp、248bp 不敏感1型/敏感型杂合子（G/V） 609bp、361bp、248bp 609bp、361bp、248bp 不敏感II型/敏感型杂合子（G/A） 609bp 609bp、361bp、248bp 不敏感I型/不敏感II型杂合子（V/A） 注：G表示氨基酸残基为Gly（甘氨酸)；V表示氨基酸残基为Val（缬氨酸)：A表示氨基酸残基为Aal（丙 氨酸)。 2