ICS 65.020.01 B 61 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 2026—2019 甘蔗 DNA 指纹图谱采集技术规程 Technical regulations for the collection of sugarcane DNA fingerprint 2019 - 12 - 05 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 2019 - 12 - 30 实施 发 布 — DB45/T 2026 2019 前 言 民。 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区糖业办公室提出并宣贯监督。 本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所。 本标准起草人：高轶静、周会、杨荣仲、熊发前、段维兴、张保青、杨翠芳、周珊、王泽平、张革 I — DB45/T 2026 2019 甘蔗 DNA 指纹图谱采集技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗DNA指纹图谱采集的术语和定义、原理、仪器设备、操作程序及数据采集。 本标准适用于广西壮族自治区范围内保育和推广的甘蔗品系、品种、杂交种以及甘蔗种质资源的DNA 指纹图谱的采集。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 简单重复序列 simple sequence repeat （SSR） 一类由几个核苷酸（一般为2～5个）为重复单位组成的简单串联重复序列。根据其保守的边界序列 设计引物，可通过PCR、电泳技术分析重复序列的重复次数变异。 2.2 核心引物组合 core primer combination 指品种DNA指纹鉴定优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好、稳定性高、电泳峰易区分 等综合特性，作为统一用于品种DNA指纹数据采集和品种鉴定的引物，以保证不同实验室数据具有可比 性。 2.3 参照品种 reference variety 对应于特定位点不同等位变异的一组品种，用于辅助确定待测样品在某个位点上等位变异扩增片段 的大小，校正仪器设备的系统误差，以保证不同实验数据具有可比性。本标准选择广西壮族自治区范围 内的主栽品种之一ROC22和重要亲本桂糖11号作为参照品种。 3 原理 由于不同甘蔗的基因组DNA存在简单重复序列的重复次数差异，这种差异可采用PCR扩增和电泳检测 获得的DNA指纹对不同品种加以区分。 4 仪器设备和试剂配制 仪器设备和试剂配制方法见附录A。 5 操作程序 1 — DB45/T 2026 2019 5.1 样品准备 每份样品至少采集两批，每批采集的样品均包括参照品种ROC22和桂糖11号；单次采集的样品独立 进行实验，作为一次重复。 5.2 DNA 提取 取嫩叶组织约0.2 g，迅速剪碎，放入盛有液氮的研钵进行充分研磨后置于离心管中，加入1 mL预热 至65 ℃的DNA提取液，65 ℃水浴30 min，期间轻缓颠倒混匀2次；12 000 rpm离心20 min，吸取上层清液 至2 mL离心管，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇混合液（25:24:1），轻缓颠倒混匀，12 000 rpm离心10 min， 取上清液转入新的2 mL离心管，再加入等体积氯仿重复抽提一次，吸取上清液至新的2 mL离心管；加入 等体积异丙醇，-20 ℃静置10 min，12 000 rpm离心10 min，弃上清液，70%酒精洗涤2次。常温干燥后加 入100 μL TE溶解，-20 ℃保存。DNA质量经OD260/280检测在1.8～2.0之间方可用于后续试验。 上述DNA提取方法为标准推荐使用，在保证DNA提取质量能够符合PCR扩增需要的前提下其它DNA提取 方法均可采用。 5.3 PCR 扩增 5.3.1 SSR 引物 5对基本核心引物名单见附录B，参照品种ROC22和桂糖11号对核心引物的指纹图谱见附录C。每对引 物的上游引物5’端用荧光标记。 5.3.2 反应体系 PCR反应体系为20 μL，其中10×PCR Buffer（含20 mmol/L Mg ）2 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μ L，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 40 ng，Taq酶1 U。 2+ 5.3.3 反应程序 95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃～65 ℃退火30 s（退火温度详见附录B），72 ℃延伸1 min， 共35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。 5.4 PCR 产物检测 5.4.1 PCR 产物样品准备 将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，从混合液中吸取1 μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。 板中每个孔分别加入1 μL GS500分子量内标和10 μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95 ℃变性5 min， 取出立即置于冰上，冷却10 min以上。离心10 s后放到DNA分析仪上。 5.4.2 开机准备 打开DNA分析仪，检查仪器工作状态，更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板放置于样品架基座 上，打开数据收集软件。 5.4.3 编板 按照仪器操作程序，创建电泳板，输入电泳板名称，选择适合的程序和电泳板类型，输入样品编号 或名称。 2 — DB45/T 2026 2019 5.4.4 运行程序 动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器中。 DNA分析仪自 6 数据采集 6.1 数据表示 eneMarker 相关软件 毛细管 效 征 包括 产 置 度 面积 进行毛细管 效 征 别将 中 度最 或者 面 积最 征 该 余 度与最 值或 者 面积与最 值来 利 产 置 征 构建 无 即 各 征 值 很清楚地将各 开 来 6.1.1 应用 G 等 对 电泳图谱有 特 数据采集， 对应 PCR 扩增 物的电 泳峰的位 、电泳峰的高 、电泳峰的 。 6.1.2 电泳图谱有 特 数据的标准化，分 每对引物 电泳峰高 高 电泳峰 大的电泳峰特 数据标准化为 1， 对引物其 电泳峰则通过其电泳峰高 高电泳峰的比 电泳峰 大电泳峰的比 标准化（参见附录 C）。 6.1.3 用对应 PCR 扩增 物大小的电泳峰的位 及其对应的电泳峰特 数据 甘蔗 DNA 指纹图谱。 通过电泳峰的有 （ 1、0 数据）以及 个电泳峰特 参数标准化 ，可以 品种区分 。 6.2 结果记录 利 毛细管 中 征 置 征 征 才 入 进行汇总 致 且 。每份样品的重 用 电泳图谱的电泳峰位 及其对应的电泳峰特 数据参照附录 D 复实验 ，参照品种 ROC22 和桂糖 11 号的电泳峰的特 参数标准化 数据一 ，并 样品的电 泳峰的特 参数标准化 数据重复性好， 样品数据 可列 DNA 指纹数据 。 值 该 值与库中 库 3 — DB45/T 2026 2019 附 录 A （规范性附录） 仪器设备和试剂配制 A.1 仪器设备 格 6孔× mL反 模块 能够 辨 少 速冷冻离心机 最 离心力 rpm 子天 精度 g 微量 调移液 格 别 μL μL μL、200 μL、1000 μL。 紫外 光光度 低温冰箱 ≤- ℃ 冰机 水浴锅 A.1.1 A.1.2 A.1.3 A.1.4 A.1.5 A.1.6 A.1.7 A.1.8 A.1.9 PCR扩增仪：规 为9 0.2 应 。 DNA分析仪： 分 至 1个核苷酸的差异。 高 ： 大 不小于12 500 。 电 平： 为0.01 。 可 器：规 分 为10 、20 、100 分 计。 ： 20 。 制 。 。 A.2 DNA提取溶液的配制(用去离子水和分析纯试剂配制) A.2.1 0.5 mol/L EDTA溶液 称取186.1 g Na EDTA•2H O，加入800 mL水，用固体NaOH调节pH至8.0，定容至1 000 mL，103.4 kPa （121 ℃）条件下灭菌20 min。 2 2 A.2.2 1 mol/L Tris-HCl溶液 称取60.55 g Tris碱，溶于400 mL水中，用HCl调节pH至8.0，定容至500 mL，103.4 kPa（121 ℃） 条件下灭菌20 min。 A.2.3 DNA提取液 称11.69 g NaCl放入烧杯中，加入40 mL 1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）和50 mL 0.5 mol/L的EDTA（pH8.0）， 加入250 mL水，再加入12 g SDS，65 ℃水浴中加热溶解，冷却后定容至400 mL。于4 ℃保存。 A.2.4 酚:氯仿:异戊醇混合液 将Tris饱和酚、氯仿和异戊醇按25:24:1的比例（V : V : V）配制混合液。 A.2.5 70%乙醇 用 量筒量取70 mL无水乙醇，用水定容至100 mL。 A.2.6 Tris-EDTA缓冲液 别量取1 mL 1 M的Tris-HCl（pH 8.0）和0.2 mL0.5 M的EDTA（pH 8.0），定容至100 mL，在103.4 kPa ℃ 条件下灭菌20 min。于4 ℃保存。 分 （121 ） 4 — DB45/T 2026 2019 A.3 PCR扩增溶液的配制(用超纯水配制) A.3.1 dNTP 用水分别配制dATP、dTTP、dGTP、dCTP 4种脱氧核糖核苷酸终浓度为100 mmol/L的储存液。分别量 取4种储存液20 μL混合，用120 μL水定容，配制成每种核苷酸终浓度为10 mmol/L的工作液。在103.4 kPa （121 ℃）条件下灭菌20 min。于-20 ℃保存。 可用购买的满足试验要求的商品试剂。 A.3.2 SSR引物 荧光标记引物为HPLC纯化，无荧光标记引物为PAGE纯化。引物干粉快速离心，用水分别配制正向引 物和反向引物至浓度为10 μmol/L。 5 — DB45/T 2026 2019 附 录 B （规范性附录） 核心引物组合基本信息 核心引物组合基本信息见表B.1。 表 B.1 核心引物组合基本信息 引物名称 SCB181 EST2-20 SCB279 SMC1604SA SMC336BS a 引物序列 F: GGC GGC TGC TTC TGG GTT TGT R:GGA AGC CGA GGA GCA CGA GGA T F:ATA AGA TCC GTG GTA GGG TAA R:AGG GAC GAA GGG AGT GC F: AGA GGG AGG ACA ACA ACA GG R:CTC CAG TCC CAG CAT AAA GAT F:AGG GAA AAG GTA GCC TTG G R:TTC CA