ICS 65.020.01 B 61 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2634—2014 棉花品种真实性鉴定 SSR分子标记法 Identification genuineness of cotton varieties using SSR markers 行业标准信息服务平台 2014-10-17发布 2015-01-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2634—2014 前 言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：安徽省农业科学院、农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心（合肥）。 本标准主要起草人：杨剑波、路曦结、何团结、陆徐忠、郑曙峰、张小娟、倪金龙。 行业标准信息服务平台 NY/T2634—2014 棉花品种真实性鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法。 本标准适用于陆地棉品种真实性鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样 GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验 GB4407.1经济作物种子纤维类 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 品种真实性 varietal genuineness 供检品种与文件记录（如标签等）是否相符。本标准中指品种间在DNA分子标记带型上的一致 性。 3. 2 SSR分子标记simple sequencerepeatmarker 是指由几个核苷酸（一般为2个～6个）为重复单元的多达几十至几百次的串联重复；由于基本单 元重复次数的不同，进而形成SSR座位的多态性；根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异 引物来扩增SSR序列，即可揭示其多态性。 3. 3 标准样品standard sample 经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，对有性繁殖作物而言，一般为种子。 息服务平 3. 4 带型patterns 某核心引物扩增特定单株DNA得到的条带类型。 4原理 根据SSR序列两端保守的单拷贝序列设计特异引物，利用PCR技术扩增和电泳分析，获得样品各 单株的SSR电泳带型。将受检样品与标准样品就单株间的带型逐一进行差异比较和判读分析，进行棉 花品种真实性鉴定。 5试剂与溶液 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。 1 NY/T 2634—2014 5.1β-巯基乙醇。 5.2异丙醇。 5.3剥离硅烷。 5.4四甲基乙二胺（TEMED)。 5.5 TaqDNA聚合酶。 5.6PCR反应缓冲液（10XBuffer）。 5.725mmol/L氯化镁溶液（MgClz）。 5.81mol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(Tris-HCI) 称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸（HCI)调pH至8.0,加水定容 到1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。 5.910mol/L氢氧化钠溶液(NaOH) 在160mL水中加人80.0g氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。 5.100.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（EDTA一Na2）（pH8.0) 称取187.6g乙二铵四乙酸二钠（EDTA一Na2）加人800mL水中，再加人适量氢氧化钠溶液，加热 至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容到1000mL。在103.4kPa(121℃) 条件下灭菌20min，4℃储存。 5.11DNA抽提液 分别称取69.3g葡萄糖，20.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),1.0g二乙基二硫代氨基甲酸(DIECA)溶 于500mL水中，然后分别加人100mL1mol/L的Tris-HCI溶液、10mL0.5mol/L的EDTA一Na2 溶液（pH8.0），定容到1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。 5.12DNA裂解液 分别称取81.7g氯化钠（NaCI)，20.0g聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，20.0g十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB），1.0g二乙基二硫代氨基甲酸（DIECA）溶于500mL水中，然后分别加入100mL1mol/L的 Tris-HCl溶液，4mL0.5mol/L的EDTA一Na2溶液（pH8.0）.定容到1000mL。在103.4kPa （121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。 5.13苯酚+氯仿+异戊醇混合液 标准信息服 体积比为25十24+1。2 5.14氯仿+异戊醇混合液 体积比为24十1。 5.1570%乙醇 量取70mL无水乙醇，加水定容到100mL 5.16SSR引物工作液 引物序列见附录A，将引物配制成终浓度均为10μmol/L的上、下游引物工作液。 5.17dNTPs混合溶液 浓度为2.5mmol/L的dNTPs混合溶液。 5.185×三羟甲基氨基甲烷/硼酸电泳缓冲液（5×TBE） 分别称取50.0gTris，27.5g硼酸溶于500mL水中，加入10mL0.5mol/L的EDTA一Na2溶液 （pH8.0），定容到1000mL，4℃储存。 5.19加样缓冲液 在98mL去离子甲酰胺中加入250mg溴酚蓝，250mg二甲苯氰，2mL0.5mol/L的EDTA-一Na2 溶液（pH8.0），溶解混勾，常温保存。 2 NY/T2634—2014 5.20亲和硅烷工作液 在1ml.无水乙醇中加人5μL亲和硅烷原液，混匀。 5.216%变性聚丙烯酰胺溶液 称取57.0g丙烯酰胺，3.0g甲叉双丙烯酰胺，420.0g尿素溶于200mL水中，加人200mL5× TBE，室温充分溶解后，定容到1000mL，4℃储存。 注：丙烯酰胺具神经毒性，配制时应注意防护。 5.2210%过硫酸铵溶液 称取10.0g过硫酸铵溶于100mL水中，4℃储存。 5.231%硫代硫酸钠 称取1.0g硫代硫酸钠，溶于100mL水中，室温储存。 5.24固定液 在89.5mL水中加入10mL无水乙醇，0.5mL冰醋酸，根据胶板数量调整固定液的量，现用现配。 5.25染色液 在100mL水中加人0.2g硝酸银（AgNO3），根据胶板数量调整染色液的量，现用现配。 5.26显影液 配。 6仪器和设备 6.1PCR扩增仪。 6.2电子天平：感量0.1g和0.1mg。 6.3台式高速冷冻离心机：最大离心力≥10000g。 6.4电泳检测系统：垂直电泳系统。 6.5酸度计：精度土0.01pH。 6.6单道微量移液器：2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。 6.7多道微量移液器：8道或12道，10μL、100μL。 业标准信息服务平 6.8冰箱：4℃、-20℃。 6.9高压灭菌锅。 6.10 0恒温水浴锅：温控精确度土1℃ 6.11脱色摇床。 6.12胶片观察灯。 7操作步骤 7.1试样的制备 受检样品和标准样品可为棉花的种子、幼苗、幼嫩叶片等。样品纯度应符合GB4407.1的规定，种 子扦样按GB/T3543.2的规定执行，种子发芽按GB/T3543.4的规定执行。 以受检样品所标注品种的标准样品作为对照，同时检测受检样品和标准样品。 7.2DNA提取 分别从受检样品和标准样品中随机抽取12粒种子或单株，利用CTAB法分单株（或单粒种子）提 取基因组 DNA。 7.2.1取单粒种子，剥壳并将种仁磨碎，移人2.0mL离心管；或取棉花幼嫩叶片约200mg~300mg， 3 NY/T2634—2014 置于2.0mL离心管中，加液氮充分研磨。 7.2.2加人1mL4℃预冷的DNA抽提液和2uLβ-巯基乙醇，充分混匀，4℃静置5min，12000r/min 离心10min，弃上清。 7.2.3加人1mL65℃预热的DNA裂解液和2Lβ-统基乙醇，充分混匀，65℃水浴30min，12000r/ min离心10 min。 7.2.4将上清液转移至新离心管中，并加人等体积的苯酚+氯仿十异戊醇混合液，充分混匀，12000r/ min，室温离心10min。 7.2.5将上清液再次转移至新离心管中，并加入等体积的氯仿十异戊醇混合液，充分混匀，12000r/ min，室温离心10min。 7.2.6吸取上清液至新离心管，并加入等体积的异丙醇，混匀，一20℃放置30min以上，充分沉淀 DNA. 7.2.75000r/min，4℃离心5min，弃上清，沉淀经70%乙醇洗涤后，室温晾干。 7.2.8加人100μL水，将DNA充分溶解后备用。 7.3PCR扩增 利用39对SSR核心引物（见附录A)逐一对受检样品和标准样品各单株DNA进行扩增。 7.3.1PCR扩增反应体系 在PCR反应管中按表1依次加人反应试剂，混匀。 表1PCR扩增反应体系 试剂 终浓度 体积 水 . 10XBuffer 1X 2.0μL 25mmol/LMgCl溶液 2.5mmol/ L 2. 0 μL dNTPs混合溶液（各2.5mmol/L） 各0.25mmol/ L 2. 0 μL 10μmol/L上游引物 0. 2 μmol/ L 0. 4 μL 10μmol/L下游引物 0. 2 μmol/ L 0. 4 μL TaqDNA聚合酶 1.0U DNA模板 2. 0μL 总体积 20. 0 μL