ICS 65.020.20 B 31 备案号：51185-2017 内 蒙 DB15 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1056—2016 香菇菌种制作技术规程 Regulation of Strain Manufacture for Lentinula edodes 2016 - 09 - 25 发布 内蒙古自治区质量技术监督局 2016 - 12 - 25 实施 发 布 DB15/T 1056—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区农牧业厅归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本标准主要起草人：孙国琴、庞杰、王勇、康立茹、解亚杰、张立华、王海燕、于静、孟虎、乔 慧蕾、李亚娇。 I DB15/T 1056—2016 香菇菌种制作技术规程 1 范围 本标准规定了香菇（Lentinula edodes）母种、原种和栽培种生产有关的定义、制作技术流程要点 等。 本标准适用于香菇母种、原种和栽培种菌种制作要求。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 9688 食品包装用聚丙烯成型品卫生标准 GB 19170 香菇菌种 GH/T 1013-2015 香菇 NY/T 528-2010 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1731 食用菌菌种良好作业规范 NY/T 1742 食用菌菌种通用技术要求 3 术语和定义 下列定义和术语适用于本文件。 3.1 香菇 lentinula edodes 香 菇 （ Lentinula edodes ） 又 名 香 孽 、 香 信 、 香 苑 、 冬 菇 、 椎 茸 ( 日 本 ) 。 属 担 子 菌 亚 门 （Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目（Aganicales）、口蘑科（Tricholomataceae）、 香菇属（Lentinus）的一类木腐菌，子实体肉质或近肉质。 [GH/T 1013-2015，定义3.1] 3.2 菌种 spawn 通过生产试验验证具有特异性、均一性和稳定性，丰产性好、抗性强的香菇菌株或品种，生长在适 宜基质上具结实性的菌丝培养物，包括母种、原种和栽培种。 3.3 母种 stock culture 经分离、杂交、诱变等各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物，以玻璃 试管和培养皿为培养容器和使用单位，也称为一级种、试管种。 1 DB15/T 1056—2016 [GB 19170-2003，定义3.1] 3.4 原种 pre-culture spawn 由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以玻璃菌种瓶或塑料菌种瓶或（12～17）cm×（22～ 28）cm×（0.04～0.05）mm聚丙烯塑料袋为容器，也称为二级种。 3.5 栽培种 spawn 由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以菌种瓶（玻璃瓶或塑料瓶）或（15～17）cm× （33～35）cm×（0.04～0.05）mm聚丙烯塑料袋为容器。栽培种只能用于栽培，不可再次扩大繁殖菌种。 也称为三级种。 3.6 固体菌种 solid spawn 以富含木质素、纤维素和淀粉等天然有机物为主要原料，添加适量的有机氮源和无机盐类，具一定 水分含量的培养基培养的纯菌丝体。 3.7 液体菌种 liquid spawn 指采用与母种营养成份相同不加琼脂的液体培养基培养而得到的纯双核菌丝体，菌丝体在培养基中 呈絮状或球状，液体菌种可以作为原种或栽培种直接接种在培养袋中。 4 菌种生产要求 4.1 人员 生产所需要的技术人员和检验人员应经过专业培训、掌握香菇基础知识及香菇菌种生产技术规程要 求。 4.2 场地、厂房要求 香菇菌种生产应选择地势高、通风良好、空气清新、水源近、排水通畅、交通便利的场所。300 m 之内无酿造厂、食用菌栽培场、集贸市场、规模养殖的畜禽舍、垃圾和粪便堆积场，无污水、废气、废 渣、烟尘和粉尘等污染源。 香菇菌种生产厂房要求有各自隔离的摊晒场、原材料库、配料分装库。配套有配料室、搅拌室、装 袋（瓶）室、灭菌室、冷却室、接种室、培养室（通风好，有纱窗）、菌种检测室及菌种冷藏库等各环 节的设施。冷却室、接种室，培养室都要有离子净化设施。 4.3 生产设备 香菇菌种生产需要粉碎机、电子秤、搅拌机、装袋（瓶）机、高压锅或常压灭菌锅、离子净化器、 超净工作台或接种箱、恒温培养箱、培养架、摇床、液体菌种灌（30 L～250 L）、冰箱、显微镜等设 备。 2 DB15/T 1056—2016 5 母种生产 5.1 培养基 见附录A。 5.2 容器 试管选用18 mm×180 mm或者20 mm×200 mm；培养皿选用直径7 cm～9 cm玻璃培养皿或一次性塑料培养 皿。 5.3 分装和灭菌 5.3.1 试管分装和灭菌 分装培养基至试管1/4处，用棉塞或硅胶塞子封闭试管口，每5支试管为1把，牛皮纸包棉塞，橡皮 筋扎紧，棉塞向上放置。棉塞应采用梳棉，不能使用脱脂棉。在121 ℃～124 ℃（0.11 MPa～0.12 MPa） 下灭菌25 min。 灭菌后温度降到（65±5）℃时，在空气清洁的室内摆斜面，要求斜面长度不超过试管长度的2/3。 从摆好的试管中抽取3 %～5 %的试管，在28 ℃下培养48 h，无微生物长出为灭菌合格。 5.3.2 培养皿分装和灭菌 培养基装入300 ml～500 ml三角瓶至刻度的2/3处，用带滤膜的封口膜封口后灭菌。培养皿用报纸包 好，同时放入灭菌锅灭菌。在121 ℃～124 ℃（0.11 MPa～0.12 MPa）下灭菌25 min。 灭菌后温度降到（65±5）℃时，在超净工作台内将三角瓶中的培养基分装至培养皿中，培养基占 培养皿高度的1/3～1/2。 5.4 接种 在超净工作台或接种箱内接种，接种前用紫外灭菌灯照射30 min，之后用75 %酒精进行表面消毒。 接菌过程严格执行无菌操作，接种后及时做好标签。 接种的菌块3 mm～5 mm，接种在培养皿或试管的中部。培养皿需用石腊膜密封。 5.5 培养 温度控制在22 ℃～26 ℃，空气湿度在75 %以下，通风避光培养。 接种后第5天、第7天和长满培养基后分别进行检验，挑出未活、污染和生长不良的不合格培养物。 检验方式应该是逐个检验。 6 原种、栽培种生产 6.1 固体菌种 6.1.1 培养基 见附录B。 6.1.2 容器 3 DB15/T 1056—2016 原种采用850 ml以下、瓶口直径≤4 cm、耐126 ℃高温的透明瓶子，或采用（12～17）cm×（22～28） cm×（0.04～0.05）mm的聚丙烯塑料袋。 栽培种采用同原种要求的瓶子，也可采用（15～17）cm×（33～35）cm×（0.04～0.05）mm的聚丙 烯塑料袋。 以上聚丙烯塑料袋均要求符合GB 9688《食品包装用聚丙烯成型品卫生标准》要求。 6.1.3 装袋（瓶） 采用装袋（瓶）机或人工进行装袋（瓶），人工装袋（瓶）需用打孔器在袋口处打孔，孔直径1 cm～ 1.5 cm深度为8 cm～12 cm，每袋（瓶）装培养基500 g～600 g。 6.1.4 灭菌 培养基质装袋（瓶）后4 h内进行灭菌，灭菌可分为高压灭菌和常压灭菌。 高压灭菌：组合培养基在121 ℃～124 ℃（0.11 MPa～0.14 MPa）下灭菌2 h；粮食培养基在121 ℃～ 124 ℃（0.11 MPa～0.14 MPa）下灭菌2.5 h。 常压灭菌：在3 h之内使灭菌温度达到100 ℃，保持100 ℃ 10 h～12 h。 6.1.5 接种 原种、栽培种在超净工作台或接种箱内接种，接种前打开紫外灯照射30 min，接种时用75 %酒精对 超净工作台或接种箱进行表面擦拭消毒。每个原种接入母种块2 cm～3 cm；每个栽培种接种量不得少于 15 g。菌种都应从容器开口处接种，不应打孔多点接种。 要严格按无菌操作接种，每批接种应为单一品种，如中途换品种时采用75 %酒精对超净工作台或接 种箱进行表面擦拭消毒。 6.1.6 培养 温度控制在22 ℃～26 ℃，空气湿度在75 %以下，通风避光培养。 6.1.7 贮存 原种和栽培种在10 ℃～15 ℃下贮存，贮存期不超过20 d，在1 ℃～6 ℃下贮存，贮存期不超过50 d。 6.2 液体菌种生产 6.2.1 培养基 见附录A中规定。灭菌同5.3.2。 6.2.2 三角瓶液体菌种生产 采用150 ml～500 ml三角瓶，培养基添加至刻度的2/3处，用带滤膜的封口膜封口后灭菌。灭菌条件 同5.4。 取3 mm～5 mm大小母种10块～15块接种在液体培养基中，在23 ℃～25 ℃，振荡频率（搅拌速度） 135 r/min～145 r/min，下振荡培养6 d～8 d。 6.2.3 菌种罐液体菌种生产条件 6.2.3.1 装罐和灭菌 4 DB15/T 1056—2016 填装培养基至液体菌种罐2/3处，按照液体菌种罐说明书要求，对液体菌种罐和液体培养基灭菌， 待液体培养基冷却至30 ℃以下时进行接种。 6.2.3.2 接种与培养 将培养好的三角瓶液体菌种接入到液体菌种罐中，接种量为培养基总体积的8 %～10 %，培养温度 3 （23±2）℃，搅拌转速140 r/min～180 r/min，灌压0.04 MPa，通风量0.7 N·m /h。培养5 d～7 d。 6.2.3.3 出菇袋接种 液体菌种可作为原种或栽培种使用，液体菌种接种在出菇袋中要采用专用液体菌种接种枪进行，严 格执行无菌操作，每袋接种10 ml～15 ml。 7 检验、入库及留样 7.1 检验 7.1.1 母种感官要求见表 1。 表1 香菇母种感官要求 项目 要求 容器 完整、无破损、无裂纹、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求 接种量（接种块大小） （3～5）mm×（3～5）mm 菌 种 外 观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 洁白、平整、无角变 菌丝体分泌物 无 菌落边缘 整齐 杂菌菌落 无 斜面背面外观 培养基不干缩，颜色均匀，无暗斑、无色素 7.1.2 原种感官要求见表 2。 表2 香菇原种感官要求 项目 容器 完整、无破损、无裂纹 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口 的距离 菌丝生长量 菌 种 外 观 要求 （50±5）mm 长满容器 菌丝体特