(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111299004.0 (22)申请日 2021.11.04 (71)申请人 中国人民解 放军海军军医大学第三 附属医院 地址 200438 上海市杨 浦区长海路2 25号 (72)发明人 王红阳　于乐兴　晏梓钧　 (74)专利代理 机构 上海申浩 律师事务所 31280 代理人 赵青 (51)Int.Cl. C12N 15/70(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 靶向肝前体细胞的质粒系统及应用 (57)摘要 本发明提供了一种靶向肝前体细胞的质粒 系统Prom1 ‑GFP‑DTR， 该质粒系统的碱基序列如 SEQ ID NO.1所示， 插入CD133启动子序列、 编码 绿色荧光蛋白和白喉毒素受体的DNA序列。 本发 明通过实验证明Pro m1‑GFP‑DTR质粒系统可有效 整合到肝前体细胞基因组中， 由于GFP的荧光标 记作用以及D TR与DT结合的清除细胞作用， Pro m1 +肝前体细胞可得到有效清除， 从而得到一种靶 向肝前体细胞的质粒系统。 权利要求书2页 说明书8页 序列表5页 附图3页 CN 114214346 A 2022.03.22 CN 114214346 A 1.一种靶向肝前体细 胞的质粒系统Prom1 ‑GFP‑DTR， 其特征在于， 该质粒系统的碱基序 列如SEQ ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的靶向肝前体细胞的质粒系统Prom1 ‑GFP‑DTR， 其特 征在于： 其中， 所述质粒系统中插入有编码CD133启动 子、 绿色荧光蛋白以及白喉毒素受体的多 核苷酸， 编码CD133启动子的碱基序列如SEQ  ID NO.2所示， 编码绿色荧光蛋白的碱基序列如 SEQ ID NO.3所示， 编码白喉毒素受体的碱基序列如SEQ  ID NO.4所示。 3.权利要求1～2任一项所述的靶向肝前体细胞的质粒系统Prom1 ‑GFP‑DTR的制备方 法， 其特征在于， 包括如下步骤： A、 无缝克隆法进行质粒构建 利用NdeI、 BsrGI对CD133启动子、 绿色荧光蛋白以及白喉毒素受体的PCR产物及载体进 行双酶切， 反应采用高盐缓冲体系， 置于37℃水浴3小 时， 充分酶切； 然后经0.8 ％琼脂糖电 泳分离后， 回收凝胶； 将酶切片断和载体按照摩尔比2： 1混合， 进行重组反应； B、 工程菌的制备 取感受态DH5α大肠杆菌于冰上融化； 向感受态DH5α大肠杆菌中加入上述构建的质粒， 轻轻混匀， 静置于冰浴中30 分钟， 42℃水浴中热激60～90秒， 快速将其置于冰浴冷却2分钟， 冷却过程中不能振 荡大肠杆菌； 加入0.9ml无菌的不含抗生素的LB培养基， 轻柔混匀 后于37 ℃， 180～200rpm摇床上培养1小时； 以600g的转速离心3分钟， 收集已转化的宿主菌， 弃去上 清， 加入含氨苄青霉素LB培养基重悬； 将已转化的宿主菌均匀涂布于含氨苄青霉素的LB琼 脂培养基上， 37℃培 养12～16小时， 即获得含有重组质粒的单 克隆菌落， 挑取克隆菌落， 加入含氨苄青霉素的LB培养基， 37℃， 180～200rpm摇床上培养12小时， 抽提宿主菌的质粒， 用NdeI、 BsrGI双酶切能够切出一条2950bp， 一条3900bp的条带， 该宿主 菌即为阳性重组子； C、 质粒pT ‑Prom1‑GFP‑DTR的抽取和纯化 取经验证为阳性重组子的单克隆宿主菌， 加入含氨苄青霉素的LB培养基， 37℃， 180～ 200rpm摇床上培养12～16小时； 菌液12000g离心2min， 弃上清， 收集菌体， 并按照试剂盒说 明进行质粒抽提和纯化。 4.根据权利要求3所述的制备 方法， 其特 征在于： 其中， 步骤B中， 所述LB培养基含1％的胰蛋白胨， 0.5％酵母提取物和1％氯化钠， pH7.0。 5.权利要求1～ 2任一项所述的质粒系统在制备治疗肝细胞肝癌药物中的用途。 6.根据权利要求5所述的用途， 其特 征在于： 其中， 所述治疗肝细胞肝癌药物为靶向肝前体细胞的药物。 7.根据权利要求6所述的用途， 其特 征在于： 其中， 靶向肝前体细胞药物的活性组分包括所述质粒系统、 带动该质粒系统发生转座 的转座子系统。 8.一种靶向肝前体细胞的药物组合物， 其特征在于， 包括活性组分以及药学上可用的 辅料， 所述活性组分包括所述质粒系统、 带动该质粒系统发生 转座的转座子系统， 所述质粒系统为权利要求1～3任一项所述的质 粒系统， 所述转座子系统为Sleeping  权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114214346 A 2Beauty转 座子系统。 9.一种治疗肝细胞肝癌的药物 组合， 其特征在于， 包括权利要求8所述的靶向肝前体细 胞的药物组合物， 以及与该 药物组合物配合使用的白喉毒素。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114214346 A 3