(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111284808.3 (22)申请日 2021.11.01 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114045291 A (43)申请公布日 2022.02.15 (73)专利权人 武汉爱博泰克生物科技有限公司 地址 430078 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新二路388号武汉光谷国际生 物医药企业加速 器1.1期7栋4层01室 (72)发明人 余乐　程威　盛鑫龙　刘佩佩　 (74)专利代理 机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 1 1401 专利代理师 张晓博 (51)Int.Cl. C12N 15/12(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01)C07K 14/705(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (56)对比文件 CN 114262718 A,202 2.04.01 CN 106119209 A,2016.1 1.16 CN 105259348 A,2016.01.20 CN 103468785 A,2013.12.25 WO 20190 30461 A1,2019.02.14 US 20170 03277 A1,2017.01.0 5 Yoshiharu Oho ka等.Semaphori n 4C, a transmembrane semaphori n, [corrected] associates w ith a neurite-outgro wth- related protei n, SFAP75. 《Bi ochemical and Biophysical Researc h Communications》 .2001, 审查员 李欣欣 (54)发明名称 重组人Sema4C蛋白、 表达载体、 宿主细胞以 及应用 (57)摘要 本申请公开了重组人Sema4C蛋白、 表达载 体、 宿主细胞以及应用。 通过选取人Sema4C基因 21‑633aa区域中的若干结构域， 构建其重组质 粒， 转染真核细胞HEK  293F细胞， 进行体外重组 表达， 获得了相关结构域的目的蛋白。 该方法具 有转染周期短和快速获得目的蛋白的效果， 能够 应用于研发阶段的摸索和大规模高通量筛选蛋 白。 权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图3页 CN 114045291 B 2022.07.19 CN 114045291 B 1.用于重组表达人源Sema4C结构域蛋白的DNA分子， 所述DNA分子为如SEQ  ID NO.1所 示中对应的5 56‑644aa结构域的编码基因。 2.一种人源Sema4C结构域蛋白的表达载体， 所述表达载体以质粒为骨架构建， 其中插 入有融合基因， 所述融合基因包含人源Sema4C结构域蛋白的编码基因以及位于所述人源 Sema4C结构域蛋白的编码基因5'端的第一序列和位于 3'端的第二序列； 所述人源Sema4C结构域蛋白的编码基因序列为如SEQ  ID NO.1所示中对应的556 ‑ 644aa结构域的编码基因； 所述第一序列如SEQ  ID NO.2或3所示， 所述第二序列为N ‑rabbit FC或C‑Human FC‑ 6His标签。 3.用于PCR扩增如权利要求2所述的表达载体 中融合基因 的引物组， 所述引物组的核苷 酸序列为如SEQ  ID NO.12~13所示或如SEQ  ID NO.14~15所示。 4.一种携带如权利要求2所述的表达载体的重组大肠杆菌 。 5.一种用于表达人源Sema4C结构域蛋白的重组表达载体的重组表达细胞， 所述重组表 达细胞为携带权利要求2所述的表达载体的H EK 293F细胞。 6.一种利用如权利要求5所述的重组表达细胞表达的重组蛋白。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114045291 B 2重组人Sem a4C蛋白、 表达载体、 宿主细胞以及应用 技术领域 [0001]本申请涉及Sem a4C基因技术领域， 尤其涉及 重组人Sema4C蛋白、 表达载体、 宿主细 胞以及应用。 背景技术 [0002]Semaphorins家族是一种分泌型或跨膜蛋白， 早期作为神经系统中一种发挥轴突 导向功能的因子被发现， 大部分蛋白通过其受体Plexins和Neur opilins家族发挥相应的生 物学效应， 包括:发育、 调节细胞运动、 血管生成、 免疫调节、 肿瘤形成和干细胞特性。 一些 Semaphorin家族成员参与了上皮细胞屏障的分离， 与肿瘤的Epithelial ‑Mesenchymal   Transition(EMT)有关， 例如， Sema3E通过激活PI3 K/ERK/MAPK使Snail在细胞核内积聚来诱 导EMT。 例如， Sema4C在调控神经轴突的定向生长和肌管发育方面有重要作用， 在人类宫颈 癌、 子宫内膜癌、 乳腺癌和前列腺癌中均表达， 并与淋巴转移等恶性行为相关。 Sema4C在乳 腺癌细胞过表达上调了转录因子Snail、 Slμg和SOX ‑2， 在肌细胞的分化过程中Sema4C是 P38MAPK信号通路的重要激活因子。 研究表 明Sema4C在宫颈癌组织的过表达与恶性生物学 行为有关， EMT与宫颈癌的进展密切相关， Seam4C成为宫颈癌侵袭转移的预测标记和治疗靶 点。 [0003]因此在体外研究或人Seam4C结构和功 能尤为重要。 现有技术中， 对人Seam4C蛋白 的重组表达一般 以原核宿主为主， 但原核表达容易产生包涵体和无生物活性的可溶性蛋 白。 因此， 需要寻找 新型重组表达人Seam4C蛋白的宿主或表达形式， 以利用获得体外获得大 量的人Seam4C蛋白， 以利于对该蛋白进行研究， 为 其作为抗肿瘤药物或诊断试剂提供帮助。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本申请的目的在于解决上述 技术问题之一。 [0005]第一方面， 本申请实施例公开了用于重组表达Sema4C蛋白的D NA分子， 其核苷酸序 列如SEQ ID NO.1所示， 所述DNA分子具有Sema4C蛋白编码基因的21 ‑663aa、 1‑497aa、 30 ‑ 497aa和556‑644aa结构域序列中的至少一种。 [0006]第二方面， 本申请实施例公开了一种Sema4C蛋白重组表达载体， 所述表达载体以 质粒为骨架构建， 其中插入有融合基因， 所述融合基因如SEQ  ID NO.1所示， 所述融合基因 包含Sema4C蛋白编码基因 的21‑663aa、 1‑497aa、 30 ‑497aa和556 ‑644aa结构域序列中的至 少一种。 [0007]在本申请实施例中， 所述融合基因还包含位于所述结构域5'端的第一序列和位于 3'端的第二序列， 所述第一序列如SEQ  ID NO.2或3所示， ， 所述第二序列为C ‑6His、 N‑ rabbit FC或C‑Human FC‑6His标签。 [0008]第三方面， 本申请实施例公开了用于PCR扩增Sema4C蛋白重组表达载体融合基因 的引物组， 其中， 所述结构域包括Sema4C蛋白编码基因的21 ‑663aa、 1‑497aa、 30 ‑497aa和 556‑644aa结构域序列中的一种； 所述引物组包括六对引物， 所述六对引物的核苷 酸序列如说　明　书 1/8 页 3 CN 114045291 B 3