(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111322947.0 (22)申请日 2021.11.10 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113755448 A (43)申请公布日 2021.12.07 (73)专利权人 广州百吉生物制药有限公司 地址 510555 广东省广州市黄埔区中新广 州知识城腾飞一 街2号318- 321房 (72)发明人 张曦　黄智宏　韩德平　燕妮　 王调霞　朱晓娜　王宁　林伟雄　 卢永　 (74)专利代理 机构 上海一平知识产权代理有限 公司 3126 6 代理人 徐迅　崔佳佳 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01)(56)对比文件 CN 113621582 A,2021.1 1.09 CN 112961248 A,2021.0 6.15 CN 111378625 A,2020.07.07 CN 109554348 A,2019.04.02 CN 112292147 A,2021.01.2 9 Nicholas F. Kuhn et al. .CD40 Ligand- Modified C himeric Antigen Receptor T Cells Enhance Antitumor Functi on by Eliciting an Endogen ous Antitumor Response. 《Cancer Cel l》 .2019,第3 5卷(第3 期), Kevin J Curran et al. .Enhanci ng Antitumor Ef ficacy of C himeric Antigen Receptor T Cel ls Through Co nstitutive CD40L Expres sion. 《The American Society of Gene & Cel l Therapy》 .2015,第23卷(第4期), 潘泽雁 等.嵌合 抗原受体T细胞治 疗胰腺癌 的现状及未来策略. 《中国癌症杂志》 .2019,第2 9 卷(第7期), 审查员 张娟 (54)发明名称 联合表达CCR2b和CD40L的工程化免疫细胞 及其制备和应用 (57)摘要 本发明提供了联合表达CCR2b和CD40L的工 程化免疫细胞及其制备和应用。 本发明将含有 NKG2D胞外域 的CAR分子与CCR2b及CD40L同时联 合表达于CAR‑T细胞中， 因此既能通过CCR2b提高 CAR‑T细胞对趋化因子的灵敏度及其向实体瘤病 灶的迁移能力； 也能通过CD40L激活机体内源的 天然和适应性免疫应答， 提高肿瘤治疗效果并降 低复发风险； 还能通过NKG2D  CAR分子识别恶性 实体瘤细胞表 面的多种靶点抗原， 降低因肿瘤异 质性或靶点抗原丢失而导致疗效下降的风险， 从 而提高肿瘤治疗的效果。 本发明的工程化免疫细胞， 可协同地显著提高针对肿瘤细胞的体外杀伤 作用。 权利要求书1页 说明书24页 序列表6页 附图7页 CN 113755448 B 2022.02.18 CN 113755448 B 1.一种工程化免疫细胞， 其特征在于， 所述工程化免疫细胞为T细胞或NK细胞， 并且所 述的免疫细胞 具有以下 特征： (a) 所述免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR， 其中所述CAR靶向肿瘤细胞的表面标志物， 其中所述CAR的抗原结合结构域包括 NKG2D的胞外结构域； (b) 所述的免疫细胞表达 外源的CCR2b蛋白； 和 (c) 所述的免疫细胞表达 外源的人CD40L蛋白； 所述NKG2D的胞外结构域的氨基酸序列如SEQ  ID NO:1第73 ‑216位所示； 所述CCR2b蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 和 所述CD40L人蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO:5所示。 2.如权利要求1所述的工程 化免疫细胞， 其特 征在于， 所述CAR的结构如式I所示： L‑NKG2D‑H‑TM‑C‑CD3ζ   (I) 式中， L为无或信号肽序列； NKG2D为NKG2D胞外结构域； H为无或铰链区； TM为跨膜结构域； C为共刺激信号结构域； CD3ζ 为源于 CD3ζ 的胞浆信号传导序列； 所述“‑”为连接肽或肽键 。 3.一种制备权利要求1所述的工程 化免疫细胞的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (A) 提供待改造的免疫细胞； 和 (B) 对所述的免疫细胞进行改造， 从而使得所述的免疫细胞表达所述的CAR分子以及 外源的CCR2b蛋白和外源的CD40L蛋白， 从而获得权利要求1所述的工程 化免疫细胞。 4.一种制剂， 其特征在于， 所述制剂含有权利要求1所述的工程化免疫细胞， 以及药学 上可接受的载体、 稀释剂或赋 形剂。 5.一种如权利要求1所述的工程化免疫细胞的用途， 其特征在于， 用于制备治疗癌症的 药物。 6.如权利要求5所述的用途， 其特征在于， 所述癌症选自下组： 结肠癌、 直肠癌、 卵巢癌 或胰腺癌。 7.如权利 要求5所述的用途， 其特征在于， 所述癌症为NKG2D配体高表达和/或趋化因子 高表达和/或CD40高表达的癌症。 8.一种用于制备权利要求1所述的工程化免疫细胞的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒 含有容器， 以及位于容器内的： (1) 第一核酸序列， 所述第一核酸序列含有用于表达所述CA R的第一表达盒， 其中所述 CAR的抗原结合结构域 为NKG2D的胞外结构域； (2) 第二核酸序列， 所述第二核酸序列含有用于联合表达 CCR2b的第二表达盒； 和 (3) 第三核酸序列， 所述第三核酸序列含有用于联合表达 CD40L的第三表达盒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113755448 B 2联合表达C CR2b和CD40L的工 程化免疫细胞及其制备和应用 技术领域 [0001]本发明属于肿瘤免疫和细胞治疗领域， 具体地， 涉及一种联合表达CCR2b和CD40L 的工程化免疫细胞。 背景技术 [0002]细胞免疫治疗是一种新兴的、 具有显著疗效的肿瘤治疗模式， 是一种自身免疫抗 癌的新型治疗方法。 它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外 培养、 修饰改造和扩增后回输到病人体内的方法， 以激发、 增强机体 自身免疫功能， 从而达 到治疗肿瘤的目的。 [0003]T细胞是参与细胞 免疫的一类重要的淋巴细胞， 通过抗原呈递细胞的信号传递， 可 以特异性地识别并杀伤肿瘤细胞。 然而， 肿瘤细胞也会通过减少或丢失抗原表 位、 免疫抑制 作用、 肿瘤异质性(即 同一种恶性肿瘤在不同患者个体间或者同一患者体内不同部位肿瘤 细胞间从基因型到表型上存在的差异)等方式阻碍T细胞的特异 性识别， 从而 逃避机体的免 疫应答。 [0004]嵌合抗原受体T细胞(chimeric  antigen receptor  T cell, CAR‑T)疗法正是针 对该问题应运而生的。 具体来说， CAR分子是一种人为设计和构建的受体 分子， 由信号肽、 胞 外抗原结合域、 铰链区、 跨膜区、 共刺激结构域、 胞内信号传导结构域等部 分组成。 因此， CAR 分子具有特异性识别肿瘤表面抗原、 激活T细胞杀伤活性和刺激T细胞增殖等功能。 通过采 集培养肿瘤患者的T细胞并以人工方法转导CAR分子的编码基因， 使患者 自体的T细胞表达 CAR分子。 回输至患者体内后， T细胞可以通过CAR分子高效且特异性地识别并杀伤肿瘤细 胞， 达到癌症治疗的效果。 [0005]CAR‑T疗法的概念从1989年首次被首次提出以来， 经历了三十年 的发展及多轮的 技术更迭(图1)。 第一代CAR ‑T仅有作为胞外抗原结合域的单链 抗体和作为胞内信号传导结 构域的CD3ζ， 无法完全激活T细胞的活性， 治疗效果不佳。 第二代CAR ‑T在第一代CAR ‑T的基 础上引入了一个共刺激结构域， 提高了T细胞的体外增殖能力和细胞因子释放水平。 第三代 CAR‑T在第二代CAR ‑T的基础上， 增加了一个共刺激结构域， 虽然可以提高T细胞的杀伤活 性， 但有可能诱发细胞因子的过量释放。 因此， 新一代CAR ‑T在第二代CAR ‑T的基础上联合表 达其他辅助因子， 例如联合表达IL ‑12或IL‑2Rβ 胞内的STAT3/5结合结构域等， 有助于提高 肿瘤杀伤活性和安全性 等效果。 [0006]虽然在血液瘤中CAR ‑T治疗获得令人满意的效果， 但CAR ‑T对于实体瘤的治疗效果 仍有很大的提升空间。 原因在于： (1)很多实体肿瘤都难以在早期被发现， 具有恶性程度高、 复发率高、 预后差等特点。 例如， 83%的结直肠癌患者在首次确诊 时已处于中晚期， 且44%的 患者已经出现了肝、 肺等部位的转移， 近 半数患者生存期不到5年； 约70%的卵巢癌患者在确 诊时， 癌细胞已经发生转移， 难以通过手术、 化疗、 放疗手段治愈， 治疗后的复发率仍高达 70%以上； 90%的胰腺癌患者被确诊时已属晚期， 5年生存率仅7%。 (2)在实体瘤治疗过程中， 肿瘤组织往往具有免疫抑制性的微环境， 可以阻碍CAR ‑T细胞的迁移和浸润。 (3)很多