(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111425242.1 (22)申请日 2021.11.26 (71)申请人 北京双赢科创生物科技有限公司 地址 100176 北京市大兴区北京经济技 术 开发区科创六街88号院7号楼3单元 301室 (72)发明人 秦志海　陶宁　李建茹　陈波　 李香群　 (74)专利代理 机构 北京知呱 呱知识产权代理有 限公司 1 1577 代理人 杜立军 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C07K 1/10(2006.01) C12N 5/09(2010.01)A61K 39/00(2006.01) A61K 47/64(2017.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备 方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于靶向肿瘤细胞的多 肽偶联物及其制备方法与应用。 所述多肽偶联物 包括靶向肿瘤细胞的插入肽、 偶联剂以及CD19多 肽； 其中， 所述插入肽通过所述偶联剂与所述 CD19多肽连接； 所述插入肽选自如下(a1)或 (a2)： (a1)氨基酸序列如SEQ  ID NO.1所述的多 肽； (a2)将SEQ  ID NO.1所示的氨基酸序列经过 一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且为具有靶向肿瘤细胞功能由(a1)衍生的 多肽。 本发 明利用了原本影 响肿瘤的发展和治疗 效果的肿瘤低氧和酸化特征， 令其成为治疗的靶 向条件， 能够将目标分子特异性的插入到肿瘤微 环境的细胞中， 给肿瘤带有特异性的标志， 为靶 向杀伤和治疗提供靶点， 从而吸引免疫细胞靶向 攻击和杀伤。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图5页 CN 114181319 A 2022.03.15 CN 114181319 A 1.一种多肽偶联物， 其特征在于， 所述多肽偶联物包括靶向肿瘤细胞的插入肽、 偶联剂 以及CD19多肽； 其中， 所述插 入肽通过 所述偶联剂与所述CD19多肽连接； 所述插入肽选自如下(a1)或(a2)： (a1)氨基酸序列如SEQ  ID NO.1所述的多肽； (a2)将SEQ  ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基 的取代和/或缺失 和/或添加且为具有靶向肿瘤 细胞功能由(a1)衍 生的多肽。 2.如权利要求1所述的多肽偶联物， 其特 征在于， 所述偶联剂为磺基琥珀酰 亚胺基4‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸酯。 3.如权利要求1所述的多肽偶联物， 其特 征在于， 所述CD19多肽的氨基酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 4.一种多肽偶联物的制备 方法， 其特 征在于包括以下步骤： 将CD19多肽分子与偶联剂连接， 得到 CD19多肽偶联物； 将所述CD19多肽偶联物与靶向肿瘤 细胞的插 入肽连接， 得到所述多肽偶联物； 所述偶联剂为磺基琥珀酰 亚胺基4‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸酯。 5.如权利要求 4所述的多肽偶联物的制备 方法， 其特 征在于， 所述CD19多肽偶联物的制备 方法为： 将4800nmol偶联剂 溶解到300 μL  PBS溶液中， 得到偶联剂 溶液； 将10nmol的CD19多肽溶 解到200 μL PBS中， 得到 CD19多肽溶 液 将偶联剂溶液和CD19多肽溶液加入到1.5mL离心管中， 室温摇晃1 ‑3小时， 控制混合溶 液的pH为7.4， 得到 CD19多肽偶联物溶 液， 纯化得CD19多肽偶联物。 6.如权利要求5所述的多肽偶联物的制备 方法， 其特 征在于， 所述CD19多肽偶联物与靶向肿瘤 细胞的插 入肽连接过程 为： 向所述纯化的CD19多肽偶联物溶液中加入4800nmol的靶向肿瘤细胞的插入肽， 室温摇 晃4‑6h反应， 纯化反应产物， 得到所述多肽偶联物。 7.如权利要求6所述的多肽偶联物的制备 方法， 其特 征在于， 所述靶向肿瘤 细胞的插 入肽为pHL IP。 8.含权利要求1 ‑3中任一项所述的多肽偶联物的细胞。 9.权利要求1 ‑3中任一项所述的多肽偶联物在制备用于肿瘤细胞的识别和/或标记和/ 或分选和/或药物靶向的产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114181319 A 2用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 具体涉及一种用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及 其制 备方法与应用。 背景技术 [0002]肿瘤微环境是由肿瘤细胞、 多种基质细胞以及一系列的细胞因子和趋化因子组 成。 其中基质细胞包括成纤维细胞、 肿瘤浸润的免疫细胞、 内皮细胞、 骨髓来源未成熟细胞 等； 细胞因子如TNF、 VEGF、 IL ‑1等； 趋化因子如CXCL12、 CCL27、 CCL21等。 细胞因子和趋化因 子可以由肿瘤细胞分泌， 亦可 由基质细胞和上述浸润的免疫细胞产生。 这些细胞和活性介 质一同形成稳定的肿瘤 免疫微环境， 保护肿瘤组织逃脱机体的免疫监视并促进肿瘤进展。 肿瘤细胞具有很强的异质性和增殖能力， 而其在生长过程中的高突变率使我们在肿瘤治疗 过程中， 很难能够找到在多种肿瘤上或者在同一种肿瘤类型的不同病人之 间稳定表达的特 异性肿瘤抗原。 [0003]肿瘤微环境中具有低氧和酸化的特质， 低氧和酸化是从良性肿瘤发展为转移生长 的恶性肿瘤的重要原因。 其中酸化对肿瘤的发展有三方面的影响： 即增加对化疗的耐受性、 增加突变率、 增强浸润性。 [0004]低pH值插入肽(pH  low insertion  peptide， PHLIP)可以在肿瘤微环境的酸性环 境下可以发生从无规则卷曲到α螺旋的构象转化， 而这种构象转化可以使其将自己插入到 肿瘤的细胞膜上， C端在细胞内， N端在细胞外。 这种在低pH值下的自组装已经被证明可以在 多种实体瘤上有效的发生。 [0005]骨髓(造血)微环境是指可以调控造血细胞增殖、 分化和功能的网络系统， 包括细 胞成分和细胞产物。 细胞成分有基质细胞和附属细胞， 基质细胞有成纤维细胞、 成骨细胞、 巨噬细胞、 内皮细胞等； 附属细胞主要为单核细胞和淋巴细胞、 骨髓 基质细胞可以产生和沉 淀复杂的细胞外基质。 [0006]T淋巴细胞在人体免疫系统， 尤其是适应性免疫系统中发挥重要的关键性作用。 其 起源于骨髓的多能干细胞， 在人体胚胎期和初生期， 前T细胞迁移至胸腺内， 在胸腺急速的 诱导下分化成熟， 成为具有免疫活性的T细胞。 成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官 的 胸腺依赖去定居， 并可经淋巴管、 外周血和组织液等进行淋巴再循环， 发挥细胞免疫的功 能。 T细胞的激活需要两条细胞信号通路的共同作用： 一条是TCR与MHC分子结合， 对T奥进 行 激活， 第二条信号通路是T细胞的CD28或者4 ‑1BB等表面蛋白与受体相结合形成共刺激信 号， 从而刺激T细胞的增殖。 两条信号通路同时作用才会真正的发挥作用。 其主要的效应行 使有两种： 与靶细胞特异 性结合， 破坏细胞膜， 直接杀伤靶细胞； 释放淋巴因子， 是免疫效应 扩大和增强。 T细胞在多种免疫作用过程中都发挥着重要作用， 在抗肿瘤的过程中也作为免 疫治疗的有力武器。 [0007]对于肿瘤和癌症治疗， 早期会选择利用手术清除加以放疗 或者化疗(紫杉醇等)的 方式进行治疗； 后来开始针对肿瘤特异性靶点完成靶向治疗； 近期人们开始了对调节人体说　明　书 1/8 页 3 CN 114181319 A 3