(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111290670.8 (22)申请日 2021.11.02 (71)申请人 辉二(上海)生物科技有限公司 地址 200131 上海市自由贸易区巴圣路16 0 号8-2单元6楼 (72)发明人 张海南　孔祥锋　陈绮佳　 (74)专利代理 机构 北京市金杜律师事务所 11256 代理人 邰红　刘盈盈 (51)Int.Cl. C12N 9/22(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/65(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12Q 1/6816(2018.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 38/46(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 31/18(2006.01) A61P 31/22(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 27/06(2006.01) A61P 27/02(2006.01) A61P 25/16(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 25/14(2006.01) A61P 25/18(2006.01) A61P 25/24(2006.01) A61P 25/36(2006.01) A61P 43/00(2006.01) A61P 21/00(2006.01) A61P 13/12(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 7/06(2006.01) (54)发明名称 新型CRIS PR-Cas12i系统 (57)摘要 本公开提供了一种Cas12i蛋白， 其包含与 SEQ ID NO:1‑10(优选地， SE Q ID NO:1‑3和6， 更 优选地， SEQ  ID NO:1)中任 一项所示的氨 基酸序 列具有至少80％， 81％， 82％， 83％， 84％， 85％， 86％， 87％， 88％， 89％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％， 99％， 99.5％或 100％同一性的氨基酸序列。 本公开还提供了一 种工程化的、 非天然存在的CRISPR ‑Cas系统， 其 包含： (1)所述Cas12i蛋白或编码所述Cas12i蛋 白的多核苷酸； 和(2)CRISPR  RNA(crRNA)或编码 所述crRNA的多核苷酸， 所述crRNA包含： (i)能够 与靶DNA的靶序列杂 交的间隔(Spacer)序列， 和 (ii)连接至所述间隔序列的能够引导所述 Cas12i蛋白结合至 所述crRNA以形 成靶向所述靶 序列的CRISPR ‑Cas复合物的直接重复(Direct  Repeat， DR)序列。 权利要求书6页 说明书68页 序列表124页 附图6页 CN 114015674 A 2022.02.08 CN 114015674 A 1.一种Cas12i蛋白， 其包含与SEQ  ID NO:1‑10(优选地， SEQ  ID NO:1‑3和6， 更优选地， SEQ ID NO:1)中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％， 81％， 82％， 83％， 84％， 85％， 86％， 87％， 88％， 89％， 90％， 9 1％， 92％， 93 ％， 94％， 95％， 96 ％， 97％， 98％， 99％， 99.5 ％ 或100％同一性的氨基酸序列。 2.前述权利 要求中任一项所述的Cas12i 蛋白， 其中所述Cas12i 蛋白实质性缺乏(例 如， 保留小于50％、 40％、 35％、 30 ％、 27.5％、 25％、 22.5％、 20 ％、 17.5％、 15％、 12.5％、 10 ％、 7.5％、 5％、 4％、 3％、 2.5％、 2％、 1％或更低的)对应的野生型Cas12i蛋 白的针对与指导序 列互补的靶DNA的靶序列的间隔序列(Spacer)特异性核酸内切酶切割活性。 3.前述权利要求 中任一项所述的Cas12i 蛋白， 其中所述Cas12i 蛋白包含在其RuvC结构 域中的一个或多个氨基酸变化使得所述Cas12i蛋白实质性缺乏(例如， 保留小于50％、 40％、 35％、 30％、 27.5％、 2 5％、 22.5％、 20％、 17.5％、 15％、 12.5％、 10％、 7.5％、 5％、 4％、 3％、 2.5％、 2％、 1％或更低的)对应的野生型Cas12i蛋白的针对与指导序列互补的靶DNA的 靶序列的间隔序列(Spacer)特异性核酸内切酶切割活性。 4.前述权利 要求中任一项所述的Cas12i 蛋白， 所述氨基酸变化选自氨基酸添加、 插入、 缺失和置换。 5.前述权利要求中任一项所述 的Cas12i蛋白， 所述Cas12i蛋白包含在与SEQ  ID NO:1 所示序列的第700位(D700)、 第650位(D650)、 第875位(E875)或第1049位(D1049)相对应的 一个或多个位置处的氨基酸置换。 6.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白， 所述氨基酸置换选自D700A/V、 D650A/V、 E875A/V和D1049 A/V。 7.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白， 所述氨基酸置换选自D700A， D650A， E875A和D1049 A。 8.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白， 所述氨基酸置换选自D700A、 D650A、 E875A、 D1049A、 D700A+D650A、 D700A+E875A、 D700A+D1049A、 D650A+E875A、 D650A+D1049A、 E875A+D1049A、 D700A+D650A+E875A、 D700A+D650A+D1049A、 D650A+E875A+D1049A、 和D700A+ D650A+E875A+D1049 A。 9.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白， 所述Cas12i蛋白包含SEQ  ID NO:79‑82 中任一项所示的氨基酸序列。 10.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白， 其连接 至一个或多个功能结构域。 11.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白， 其中所述功能结构域与所述Cas12i蛋 白的N末端和/或C末端连接 。 12.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白， 其中所述功能结构域选自核定位信号 (NLS)、 核输出信 号(NES)、 脱氨酶(例如腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶)催化结构域、 DNA甲基化 催化结构域、 组蛋白残基修饰结构域、 核酸酶催化结构域、 荧光蛋白、 转录修饰因子、 光门控 因子、 化学诱导型 因子、 染色质可视化因子、 提供与靶细胞或靶细胞类型上的细胞表面部分 的结合的靶向多肽。 13.前述权利 要求中任一项所述的Cas12i 蛋白， 其中所述功能结构域表现出修饰靶DNA 的活性， 其选自： 核酸 酶活性、 甲基化活性、 脱甲基化活性、 DNA 修复活性、 DNA损伤活性、 脱氨 基活性、 歧化酶活性、 烷基化活性、 脱嘌呤活性、 氧化活性、 嘧啶二聚体形成活性、 整合酶活权　利　要　求　书 1/6 页 2 CN 114015674 A 2性、 转座酶活性、 重组酶活性、 聚合 酶活性、 连接酶活性、 解旋酶活性、 光裂合酶活性、 糖基化 酶活性、 乙酰基转移酶活性、 脱乙酰酶活性、 激酶活性、 磷酸酶活性、 泛素连接酶活性、 去泛 素化活性、 腺苷酸化活性、 脱腺苷酸化活性、 SUMO化活性、 脱SUMO化活性、 核糖基化活性、 脱 核糖基化活性、 豆蔻酰化活性、 脱豆蔻酰化活性、 糖基化活性(例如， 来自O ‑GlcNAc转移酶)、 脱糖基化活性、 转录抑制活性、 转录 激活活性。 14.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白， 其中所述功能结构域选自腺苷脱氨酶 催化结构域或胞苷脱氨酶催化结构域。 15.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白， 其中所述功能结构域是TadA8e的全长 或功能性片段。 16.前述权利要求中任一项所述 的Cas12i蛋白， 所述Cas12i蛋白包含SEQ  ID NO:85所 示的氨基酸序列。 17.前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白， 其被修饰以降低或消除间隔序列非特 异性核酸内切酶旁切活性。 18.一种编码前述权利要求中任一项所述的Cas12i蛋白的多 核苷酸。 19.前述权利要求中任一项所述的多 核苷酸， 其被密码子优化以在真核细胞中表达 。 20.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸， 其包含与SEQ  ID NO:11‑20和SEQ ID NO: 37‑46中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％， 81％， 82％， 83％， 84％， 85％， 86％， 87％， 88％， 89％， 9 0％， 91％， 92％， 9 3％， 94％， 9 5％， 96％， 97％， 98％， 99％， 99.5％或100％同一 性的核苷酸序列。 21.一种载体， 其包 含前述权利要求中任一项所述的多 核苷酸。 22.前述权利要求中任一项所述的载体， 其中所述多 核苷酸可操作地连接 至启动子 。 23.前述权利要求中任一项所述的载体， 其中所述