(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111418036.8 (22)申请日 2021.11.25 (71)申请人 广西医科 大学 地址 530021 广西壮 族自治区南宁市双拥 路22号 (72)发明人 卢小玲　杨晓梅　王旋　丁自强　 高丽　 (74)专利代理 机构 北京格允知识产权代理有限 公司 11609 代理人 谭辉 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C07K 16/40(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 抗EGFRvⅢ的纳米抗体EGF RvⅢ/Nb1-11及其 制备方法与应用 (57)摘要 本发明公开了抗EGFRv Ⅲ的纳米抗体EGFRv Ⅲ/Nb1‑11及其制备方法与应用。 本发明所提供 的纳米抗体EGFRv Ⅲ/Nb1‑11， 包含抗原决定簇互 补区CDR和骨架区FR； 所述纳米抗体EGFRv Ⅲ/ Nb1‑11的抗原决定簇互补区CDR由CDR1、 CDR2和 CDR3组成； 通过本发明所公布的纳米抗体EGFRv Ⅲ/Nb1‑11核苷酸序列及宿主细胞， 该纳米抗体 EGFRvIII/Nb 1‑11能够在大肠杆菌内高效表达， 可以应用于EGFRv Ⅲ分子检测试剂的研发， 及制 备靶向表达EGF RvⅢ的肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑 制剂。 权利要求书2页 说明书6页 序列表3页 附图2页 CN 114349859 A 2022.04.15 CN 114349859 A 1.一种纳米抗体， 包 含抗原决定 簇互补区CDR和骨架区FR； 其特 征在于： 所述纳米抗体的抗原决定 簇互补区CDR由CDR 1、 CDR2和CDR3组成； 所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ  ID No.9的第26 ‑35位氨基酸； 所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ  ID No.9的第51 ‑60位氨基酸； 所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ  ID No.9的第101 ‑110位氨基酸。 2.根据权利要求1所述的纳米抗体， 其特 征在于： 所述骨架区FR由FR 1、 FR2、 FR3和FR4组成； 其中所述FR1的氨基酸序列为序列表中SEQ  ID No.9的第1 ‑25位氨基酸； 所述FR2的氨 基酸序列为序列表中SEQ  ID No.9的第36 ‑50位氨基酸； 所述FR3的氨基酸序列为序列表中 SEQ ID No.9的第61 ‑100位氨基酸； 所述FR4的氨基酸序列为序列表中SEQ  ID No.9的第 111‑121位氨基酸。 3.根据权利要求1所述的纳米抗体， 其特 征在于： 所述纳米抗体包 含如序列表中SEQ  ID No.9所示的氨基酸序列； 优选的是， 所述纳米抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ  ID No.9所示。 4.根据权利要求1至 3中任一项所述的纳米抗体， 其特 征在于： 所述纳米抗体在氨基末端或羧基末端连接上用于方便纯化的标签氨基酸序列； 优选的是， 所述标签氨基酸序列选自由Poly ‑Arg序列、 Poly ‑His序列、 FLAG序列、 Strep‑tag II序列、 c ‑myc序列和HA序列中的一种标签氨基酸序列， 其中Poly ‑Arg序列为 (R)n， n为5或6， 优选为6； Poly ‑His序列为(H)m， m为2‑10， 优选为6； FLAG序列为DYKDDDDK； Strep‑tag II序列为WSHPQFEK； c ‑myc序列为EQKL ISEEDL； HA序列为YPYDVP DYA。 5.与权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体相关的生物材料， 其中， 所述生物材料为 B1） 至B12） 中的任一种： B1） 编码权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体的核酸分子； B2） 含有B1） 所述核酸分子的表达盒； B3） 含有B1） 所述核酸分子的重组载体； B4） 含有B2） 所述表达盒的重组载体； B5） 含有B1） 所述核酸分子的重组微 生物； B6） 含有B2） 所述表达盒的重组微 生物； B7） 含有B3） 所述重组载体的重组微 生物； B8） 含有B4） 所述重组载体的重组微 生物； B9） 含有B1） 所述核酸分子的转基因动物细胞系； B10） 含有B2） 所述表达盒的转基因动物细胞系； B11） 含有B3） 所述重组载体的转基因动物细胞系； B12） 含有B4） 所述重组载体的转基因动物细胞系； 所述核酸分子的核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.8的cDNA分子或DNA分子 。 6.衍生自权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体的衍生抗体， 其中， 所述衍生抗体为 下述a)或b)或c)或d)或e)： a)含有权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体的单链抗体； b)含有a)所述单链抗体的融合 抗体；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114349859 A 2c)含有权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体的融合 抗体； d)含有权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体的Fab； e)含有权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体的完整抗体。 7.一种权利要求1至4中任一项所述纳米抗体的制备方法， 其特征在于， 所述方法包括 如下步骤： (1)将编码权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体的核酸分子导入受体细胞， 得到表 达所述纳米抗体的转基因细胞； (2)培养所述转基因细胞， 得到所述纳米抗体； 优选的是， 编码权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体的核酸分子包含序列表中SEQ   ID No.8所示的核苷酸序列； 更优选的是， 编码权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体的核酸分子的核苷酸序列如 序列表中SEQ  ID No.8所示。 8.根据权利要求 4所述的方法， 其特 征在于： 所述受体细胞为 微生物细胞。 9.下述A1 ‑A4中的任一种用途： A1、 权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体在结合表达 EGFRvⅢ的T细胞中的应用； A2、 权利要求5所述的生物材 料在结合表达 EGFRvⅢ的T细胞中的应用； A3、 权利要求6所述的衍 生抗体在结合表达 EGFRvⅢ的T细胞中的应用； A4、 权利要求 4所述方法在结合表达 EGFRvⅢ的T细胞中的应用。 10.下述C1 ‑C8中的任一种用途： C1、 权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的 应用； C2、 权利要求5所述的生物材 料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤 细胞抑制剂中的应用； C3、 权利要求6所述的衍 生抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤 细胞抑制剂中的应用； C4、 权利要求7 所述的制备 方法在制备肿瘤抑制剂或肿瘤 细胞抑制剂中的应用； C5、 权利要求1至4中任一项所述的纳米抗体在制备抑制EGFRV Ⅲ活性或促进T细胞增殖 的产品中的应用； C6、 权利要求5所述的生物材料在制备抑制EGFRv Ⅲ活性或促进T细胞增殖产品中的应 用； C7、 权利要求6所述的衍生抗体在制备抑制EGFRv Ⅲ活性或促进T细胞增殖产品中的应 用； C8、 权利要求7所述的制备方法在制备抑制EGFRv Ⅲ活性或促进T细胞增殖产品中的应 用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114349859 A 3