(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111383531.X (22)申请日 2021.11.22 (71)申请人 东莞市麦亘生物科技有限公司 地址 523000 广东省东莞 市松山湖高新 技 术产业开发区创新科技园9栋208室 (72)发明人 李相鲁　张严冬　张兆辰　 (74)专利代理 机构 北京冠和权律师事务所 11399 代理人 时嘉鸿 (51)Int.Cl. C12N 15/867(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/24(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 5/10(2006.01)A61K 39/00(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 38/20(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应 用 (57)摘要 本发明公开了一种靶向TRBC1CAR ‑T细胞的 制备方法与应用， 包括如下步骤： ( 1)构建携带 TRBC1‑CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒 质粒； (2)将携带TRBC1 ‑CAR及抗体或细胞因子基 因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞， 制备可感染T细胞的重组慢病毒载体； (3)从供者 提供的外周血中分离PBMC， 使用磁珠分离、 活化T 细胞； (4)将步骤(2)所得的重组慢病毒载体转导 进入T细胞， 产生表 达TRBC1‑CAR的同时分泌 抗体 或细胞因子 的CAR‑T细胞； (5)将步骤(4)所得细 胞体外培养； (6)将步骤(5)所得细胞大量扩增； (7)收集CAR ‑T细胞。 本发明该CAR ‑T细胞表达 TRBC1‑CAR同时可以分泌抗体或细胞因子， 能更 好的克服肿瘤微环境的免疫抑制， 增强CAR ‑T细 胞对肿瘤细胞的杀伤能力。 权利要求书1页 说明书10页 序列表3页 CN 114181971 A 2022.03.15 CN 114181971 A 1.一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备 方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： (1)构建携带TRBC1 ‑CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒； (2)将携带TRBC1 ‑CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主 细胞， 制备 可感染T细胞的重组慢病毒载体； (3)从供者 提供的外周血中分离PBM C， 使用磁珠分离、 活化T细胞； (4)将步骤(2)所得的重组慢病毒载体转导进入T细 胞， 产生表达TRBC1 ‑CAR的同时分泌 抗体或细胞因子的CAR ‑T细胞； (5)将步骤(4)所 得细胞体外 培养； (6)将步骤(5)所 得细胞大量扩增； (7)收集表达TRBC1 ‑CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR ‑T细胞。 2.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备方法， 其特征在于： 所述抗 体为PD‑1抗体。 3.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备方法， 其特征在于： 所述细 胞因子为 IL18细胞因子 。 4.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备方法， 其特征在于： 所述 TRBC1‑CAR所包含的scFv区域 为优化密码子后得到的序列， 如SEQ  ID NO.1所示。 5.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备方法， 其特征在于： 所述重 组慢病毒质粒 是靶向TRBC1抗原且分泌I L18细胞因子的慢病毒转基因质粒。 6.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备方法， 其特征在于： 所述重 组慢病毒质粒 是第三代 慢病毒转基因质粒。 7.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备方法， 其特征在于： 所述重 组慢病毒载体依此包含CMV启动子序列、 TRBC1单链抗体、 C ‑myc表位标记、 CD8α 嵌合受体跨 膜区、 胞内信号传导区、 EF1启动子序列、 I L2SS序列、 PD‑1抗体序列。 8.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备方法， 其特征在于： 步骤(2) 中所述的重组慢病毒载体将靶向TRBC1抗原的嵌合抗原受体表达在T细胞表 面， 同时能够分 泌IL18细胞因子 。 9.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备方法， 其特征在于： 所述宿 主细胞为2 93FT细胞或2 93T细胞。 10.一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞， 用于制备抗肿瘤的细 胞治疗药物， 特别是靶向TRBC1阳 性的肿瘤干细胞的细胞治疗药物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114181971 A 2一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 特别是涉及一种靶 向TRBC1 CAR‑T细胞的制备方 法。 背景技术 [0002]嵌合抗原修饰的T细胞(Chimer icAntigen  Receptor  modifiedT  cell， CAR ‑T) 是 一种经过基因改造的T细胞， 利用基因转导技术将含有肿瘤抗原特异性识别单链抗体 (scFv)和 T细胞激活基序的CAR导入患者T细胞， 使得这些转导了CAR的T细胞能直接识别癌 细胞表面抗原而活化， 进而 杀死癌细胞。 正是 因为CAR‑T细胞杀伤癌细胞不需要 借助抗原递 呈， 而大大提高癌细胞 杀伤效率。 [0003]2012年美国宾夕法尼亚大学Carl  June教授使用靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的 T细胞治愈白血病患儿EmilyWhitehead， 2017年美国FDA又突破性批准两款CAR ‑T细胞药物 用于B细胞白血病和淋巴瘤治疗， 成为细胞治疗领域的一个里程碑。 发明内容 [0004]本发明主要解决的技术问题是提供一种靶向TRBC1  CAR‑T细胞的制备方法与应 用， 该CAR ‑T细胞表达TRBC1 ‑CAR同时可以分泌抗体或细胞因子， 能更好的克服肿瘤微环境 的免疫抑制， 增强CAR ‑T细胞对肿瘤 细胞的杀伤能力。 [0005]为解决上述技术问题， 本 发明采用的一个技术方案是： 一种靶向TRBC 1 CAR‑T细胞 的制备方法， 包括如下步骤： [0006](1)构建携带TRBC1 ‑CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒； [0007](2)将携带TRBC1 ‑CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染 宿主细胞， 制备 可感染T细胞的重组慢病毒载体； [0008](3)从供者 提供的外周血中分离PBM C， 使用磁珠分离、 活化T细胞； [0009](4)将步骤(2)所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞， 产生表达  TRBC1‑CAR的同 时分泌抗体或细胞因子的CAR ‑T细胞； [0010](5)将步骤(4)所 得细胞体外 培养； [0011](6)将步骤(5)所 得细胞大量扩增； [0012](7)收集表达TRBC1 ‑CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR ‑T细胞。 [0013]进一步地说， 所述 抗体为PD‑1抗体。 [0014]进一步地说， 所述细胞因子为 IL18细胞因子 。 [0015]进一步地说， 所述TRBC1 ‑CAR所包含的scFv区域为优化密码子后得到的序列， 如 SEQ ID NO.1所示。 [0016]进一步地说， 所述重组慢病毒质粒是靶 向TRBC1抗原且分泌IL18细胞因子的慢病 毒转基因质粒。 [0017]进一步地说， 所述重组慢病毒质粒 是第三代 慢病毒转基因质粒。说　明　书 1/10 页 3 CN 114181971 A 3