(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111359466.7 (22)申请日 2021.11.16 (71)申请人 东莞市麦亘生物科技有限公司 地址 523000 广东省东莞 市松山湖高新 技 术产业开发区创新科技园9栋208室 (72)发明人 李相鲁　张严冬　张兆辰　 (74)专利代理 机构 北京冠和权律师事务所 11399 代理人 时嘉鸿 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 9/22(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 15/62(2006.01)C12N 15/90(2006.01) C07K 19/00(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种通用型异体 CAR-T细胞制备方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种通用型异 体CAR‑T细胞制 备方法及应用， 包括以下步骤： S1、 在T细胞中引 入siRNA分子和Cas9分子； S2、 在所述T细胞中引 入CAR分子； 其中， 所述 siRNA分子包含与来自TCR 的a链和/或β链恒定编码区基因的靶区域互补 的靶向结构域； 其中， 通过病毒转染技术将所述 siRNA分子和编码Cas9分子的mRNA引入所述T细 胞中。 本发明制备的通用型CAR ‑T细胞避免了输 注到患者体内的T细胞出现GVHD以及潜在的TCR 受体信号干 扰。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 CN 114107214 A 2022.03.01 CN 114107214 A 1.一种通用型异体CAR ‑T细胞制备 方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： S1、 在T细胞中引入siRNA分子和Cas9分子； S2、 在所述T细胞中引入CAR分子； 其中， 所述siRNA分子包含与来自TCR的a链和/或β 链恒定编码区基因的靶区域互补的 靶向结构域； 其中， 通过病毒转染技 术将所述siRNA分子和编码Cas9分子的mRNA引入所述T细胞中。 2.根据权利 要求1所述的通用型异体CA R‑T细胞制备方法， 其特征在于： 所述CA R分子通 过慢病毒转染技 术引入所述T细胞中。 3.根据权利要求1所述的通用型异体CAR ‑T细胞制备方法， 其特征在于： 所述靶向结构 域的序列如SEQ  ID NO:3所示。 4.根据权利 要求1所述的通用型异体CA R‑T细胞制备方法， 其特征在于： 所述CA R包含顺 序连接的上膜信号区、 CD 8铰链区、 克隆位 点区、 跨膜区和胞内信号区。 5.根据权利要求1所述的通用型异体CAR ‑T细胞制备方法， 其特征在于： 所述上膜信号 区的核苷酸序列如SEQ  ID No:1或SEQ ID No:2所示。 6.根据权利 要求1所述的通用型异体CA R‑T细胞制备方法， 其特征在于： 所述CD8铰链区 的核苷酸序列如SEQ  ID No:4或SEQ ID No:5所示。 7.根据权利要求1所述的通用型异体CAR ‑T细胞制备方法， 其特征在于： 所述克隆位点 区的核苷酸序列如SEQ  ID No:6或SEQ ID No:7所示。 8.根据权利要求1所述的通用型异体CAR ‑T细胞制备方法， 其特征在于： 所述跨膜区的 核苷酸序列如SEQ  ID No:8或SEQ ID No:9所示。 9.根据权利要求1所述的通用型异体CAR ‑T细胞制备方法， 其特征在于： 所述胞内信号 区的核苷酸序列如SEQ  ID No:10、 SEQ ID No:11或SEQ ID No:12所示。 10.权利要求1 ‑9中任一所述方法在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114107214 A 2一种通用型异体CAR ‑T细胞制备方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于生物细胞学技术领域， 特别是涉及一种通用型异体CAR ‑T细胞制备方 法。 背景技术 [0002]近几年， 肿瘤免疫治疗进入了快速 发展阶段， CAR ‑T疗法作为其中一种重要的方法 在血液学恶性肿瘤治疗中取得了非常令人鼓舞的结果。 目前， 国内越来越的企业、 医院及学 术机构加入到这一研究领域中， 共同推进CAR ‑T疗法的发展， 探索更为广泛的潜在应用价 值。 [0003]目前， 在嵌合抗原受体T细胞(CAR ‑T)治疗领域， 主要是采用自体的CAR ‑T细胞进行 治疗， 基本过程是采集患者自己的外周血， 分离T细胞， 并完成CAR ‑T细胞的制备和回输。 因 受限于免疫系统自身的某些限制性因素， 如CAR ‑T异体回输时由于免疫原性等原因导致的 免疫排斥、 移植物抗宿主反应(GVHD)等， 这将限制CAR ‑T细胞治疗技术广泛性和便捷性应 用， 同时也在一定程度上提高了该技术的成本， 另外， 对于婴儿患者、 或者70岁以上的老年 患者， 或者一些经过多次放化疗而摧毁免疫系统或者使T细胞功能弱化的肿瘤患者， 其自体 的T细胞的质量和数量达不到要求， 是不适合制备CAR ‑T进行肿瘤 治疗的。 所以， 通用型CAR ‑ T技术将是今后的一个方向。 发明内容 [0004]本发明主要解决的技术问题是提供一种通用型异体CAR ‑T细胞制备方法及应用， 制备的通用型CAR ‑T细胞避免了输注到患者体内的T细胞出现GVHD以及潜在的TCR受体信号 干扰。 [0005]为解决上述技术问题， 本 发明采用的一个技术方案是： 一种通用型异体CAR ‑T细胞 制备方法， 包括以下步骤： [0006]S1、 在T细胞中引入siRNA分子和Cas9分子； [0007]S2、 在所述T细胞中引入CAR分子； [0008]其中， 所述siRNA分子包含与来自TCR的a链和/或β 链恒定编码区基因的靶区域互 补的靶向结构域； [0009]其中， 通过病毒转染技术将所述siRNA分子和编码Cas9分子的mRNA引入所述T细胞 中。 [0010]进一步地说， 所述CAR分子通过慢病毒转染技 术引入所述T细胞中。 [0011]进一步地说， 所述靶向结构域的序列如SEQ  ID NO： 3所示。 [0012]进一步地说， 所述CAR包含顺序连接的上膜信号区、 CD8铰链区、 克隆位点区、 跨膜 区和胞内信号区。 [0013]进一步地说， 所述上膜信号区的核苷酸序列如SEQ  ID No： 1或SEQ ID No： 2所示。 [0014]进一步地说， 所述CD 8铰链区的核苷酸序列如SEQ  ID No： 4或SEQ ID No： 5所示。说　明　书 1/9 页 3 CN 114107214 A 3